Summary
Описана простая процедура выращивания аксенической Делии антиква с помощью полуферментированных стерильных рационов. С помощью ПЦР в каждом возрасте аксенической D. antiqua был обнаружен только один штамм Wolbachia.
Abstract
Аксенические насекомые получают из стерильных систем искусственного выращивания с использованием стерильных сред. Эти насекомые, отличающиеся небольшими размерами, коротким циклом роста и низкой потребностью в корме, идеально подходят для изучения взаимоотношений между микроорганизмами и хозяевами. Микробиота кишечника оказывает существенное влияние на физиологические характеристики насекомых-хозяев, и введение специфических штаммов аксеническим насекомым обеспечивает метод проверки микробных функций кишечника. Delia antiqua, опасный вредитель отряда Diptera, семейства Anthomyiidae и рода Delia, в основном питается луком, чесноком, луком-пореем и другими овощами семейства Лилейные. Его личинки питаются луковицами, вызывая гниение, увядание и даже гибель целых растений. При выращивании личинок аксенических растений можно проводить последующие исследования для наблюдения за влиянием кишечной микрофлоры на рост и развитие D. antiqua. В отличие от метода, предполагающего уничтожение антибиотиками ассоциированных микробов, в данной статье представлен малозатратный и высокоэффективный подход к выращиванию аксенической D. antiqua. После поверхностной стерилизации яиц D. antiqua для выращивания личинок использовали полуферментированные стерильные диеты, а аксеническое состояние D. antiqua проверяли с помощью культурально-зависимых и культурно-независимых анализов. В заключение следует отметить, что сочетание стерилизации яиц насекомых и приготовления стерильных рационов для культивирования личинок позволило разработать эффективный и простой метод получения аксенической D. antiqua. Этот метод обеспечивает мощный подход к изучению взаимодействия насекомых и микрофлоры.
Introduction
Аксенические животные, определяемые как животные, у которых не могут быть обнаружены жизнеспособные микроорганизмы или паразиты, являются ценными экспериментальными моделями для изучения взаимодействий между хозяином и микроорганизмом 1,2. Насекомые, самая многочисленная группа беспозвоночных, могут образовывать симбиотические отношения с микроорганизмами3. Аксенические насекомые могут быть использованы для изучения взаимодействий между хозяином и симбионтом в симбиотических системах4. Например, Nishide et al.5 разработали практическую стерильную процедуру выращивания червя Plautia stali с дурным запахом, позволяющую проводить надежный и строгий анализ взаимодействий между хозяином и симбионтом в модельных симбиотических системах. Аксенические насекомые могут быть получены путем стерилизации стадии яйца и обеспечения стерильной пищей личинок и взрослых особей 6,7. Аксенические насекомые имеют большое значение и широко используются в биологических исследованиях. Например, исследование, проведенное Somerville et al.8, показало, что бабочки, инокулированные Enterobacter cloacae, улучшают приспособляемость трансгенных самцов.
Delia antiqua Meigen является экономически важным вредителем лука и других культур семейства Liliaceae во всем мире, его личинки повреждают луковицы лука и других культур семейства Liliaceae9. D. antiqua в основном встречается в умеренном климате и широко распространен в районах выращивания лука в Северной и Южной Америке, Европе и Азии. При отсутствии надлежащего контроля он может привести к потерям урожая лука (Allium cepa L.), чеснока (Allium sativum L.), лука-шалота (Allium fistulosum L.) и лука-порея (Alliumchoenoprasum L.) в диапазоне от 50% до 100%10,11. Личинки питаются подземными частями растений, и эта подкормка вызывает увядание и в конечном итоге гибель рассады. Кроме того, поврежденные растения могут позволить болезнетворным микроорганизмам проникнуть внутрь, что приведет к загниванию луковиц12. Даже если растения не полностью съедены личинками, ущерб, который они наносят, делает растения лука нетоварным и приводит к экономическим потерям.
Насекомые тесно связаны с микробиотой кишечника, и большинство кишечника насекомых содержат различные симбиотические бактерии, которые процветают за счет питательных веществ, поставляемых хозяином13,14. Jing et al.15 показали, что основной функцией кишечного симбиотического сообщества является обеспечение необходимыми питательными веществами, за которыми следуют функции, связанные с пищеварением и детоксикацией. В некоторых случаях кишечные бактерии могут служить микробным ресурсом для борьбы с вредителями. Следовательно, желательно изучение характеристик и специфических функций отдельных кишечных бактерий в организме D. antiqua. Поэтому подготовка личинок аксенических особо важна для изучения взаимодействий между конкретными штаммами бактерий и насекомыми16. В настоящее время широко используемым методом уничтожения кишечных бактерий насекомых является использование комбинации антибиотиков для уничтожения ассоциированных микробов 17,18,19. В отличие от использования только антибиотиков, которые могут только уменьшить количество микробов, аксеническое выращивание насекомых позволяет контролировать состав и количество микроорганизмов, что позволяет более точно проверять функциональность микробиоты кишечника.
Таким образом, в данной статье представлен протокол подготовки и выращивания аксенического D. antiqua. Корм для личинок аксенических получают путем высокотемпературной стерилизации натуральных рационов в сочетании с полуферментированными продуктами. Яйца стерилизуют в соответствии с экспериментальным протоколом для получения аксенических яиц, и, наконец, из аксенических яиц культивируют личинок аксена. Для эксперимента аксеническая система выращивания проводилась только для одного поколения. Это обеспечит удобство для изучения взаимодействия насекомых и микробиоты кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
D. antiqua добывают с месторождения Фаньчжэнь, Тайань.
1. Приготовление стерильных рационов
- Снимите внешние слои зеленого лука и выбросьте зеленые листья. Сохраните белую часть зеленого лука (рисунок 1А) и промойте их стерильной водой, повторив процесс ополаскивания три раза. Белую часть зеленого лука нарезать кубиками по 1-2 см ножницами (см. Таблицу материалов), стерилизованными 75% раствором EtOH (упомянутым в шаге 2.5) для последующего использования.
- Взвесьте 50 г нарезанного кубиками зеленого лука и поместите его в кухонный комбайн (см. Таблицу материалов). Добавьте 50 мл стерилизованной воды и измельчите их пять раз по 2 минуты каждый. Весь нарезанный кубиками зеленый лук должен быть измельчен до пастообразной консистенции (Рисунок 2A).
- Пинцетом переложите 10 штук личинок D. antiqua 3-го возраста в центрифужную пробирку объемом 10 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и измельчите их одноразовым шлифовальным пестиком (см. Таблицу материалов) в течение примерно 5 мин до получения жидкости для измельчения личинок.
- Перелейте пастообразную жидкость для зеленого лука и жидкость для измельчения личинок в чистую коническую колбу объемом 500 мл (см. Таблицу материалов). Оберните коническое горлышко колбы двумя слоями прозрачной герметизирующей пленки, а затем поместите колбу во встряхивающий инкубатор (см. таблицу материалов) для ферментации при 25 °C и 180 об/мин в течение 12 ч (рисунок 2B).
- Вырежьте ножницами семь слоев квадратной марли со сторонами 10 см (стерильность не нужна) и сложите их вместе, чтобы сформировать простое фильтрующее устройство. Медленно вылейте ферментированную жидкость из зеленого лука на марлю и отожмите отфильтрованную жидкость в новую коническую колбу объемом 500 мл. Оставшиеся остатки зеленого лука заверните на марлю в оловянную фольгу для последующего использования.
- Фильтрат, полученный на предыдущем этапе, отфильтруйте с помощью вакуумного насоса (см. Таблицу материалов) и воронки Бюхнера. Смоченную деионизированной водой фильтровальную бумагу положите на воронку Бюхнера, а затем залейте фильтрат и трижды выполните всасывающую фильтрацию с помощью разной фильтровальной бумаги. Соберите конечный фильтрат в коническую колбу объемом 500 мл.
- Выполните еще одну фильтрацию с помощью фильтрующего флакона 0,22 мкМ и вакуумного насоса. Закрутите крышку колбы всасывающего фильтра в сверхчистом столе (см. Таблицу материалов) для дальнейшего использования. На этом этапе получают ферментированный остаток зеленого лука и фильтрат (Рисунок 2C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отфильтрованная жидкость, полученная на этом этапе, будет стерильной. (Флакон с фильтром 0,22 мкМ представляет собой стерильную вакуумную систему фильтрации для стерилизации фильтрата). - Повторите предыдущие шаги, чтобы получить неферментированный остаток зеленого лука и фильтрат. Здесь разница в том, что брожение не нужно.
- Взвесьте 0,24 г холина хлорида и 0,56 г L-аскорбиновой кислоты (см. таблицу материалов) в центрифужной пробирке объемом 10 мл. Добавьте 3 мл деионизированной воды и энергично встряхивайте до полного растворения. В сверхчистом столе используйте новый шприц объемом 5 мл и прикрепите три шприцевых фильтра 0,22 мкМ (см. Таблицу материалов) для стерилизации раствора и поместите его в стерильную центрифужную пробирку объемом 10 мл для последующего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хлорид холина является важным нейромедиатором для роста насекомых, в то время как L-аскорбиновая кислота действует как консервант. - Взвесьте 2 г порошка агара и 6 г БСЭ (см. таблицу материалов) и перелейте их в коническую колбу объемом 500 мл. Затем добавляют 100 мл деионизированной воды для приготовления питательной среды. После ополаскивания стеклянного стержня деионизированной водой используйте его для перемешивания смеси до тех пор, пока она хорошо не перемешается. Затем запечатайте коническую колбу с помощью двух слоев прозрачной уплотнительной пленки.
- Ферментированный зеленый лук и неферментированный зеленый лук (упомянутые на шагах 1.5 и 1.8) завернуть в алюминиевую фольгу и стерилизовать их вместе с питательной средой в автоклаве при температуре 121 °C в течение 20 минут.
- В сверхчистом стенде налейте стерилизованный хлорид холина, L-аскорбиновую кислоту и стерильный фильтрат в питательную среду, осторожно перемешивая, чтобы тщательно перемешать. Наконец, добавьте ферментированный и неферментированный зеленый лук и энергично встряхните вручную, чтобы получить стерильную диету. Насыпьте корма в центрифужные пробирки объемом 50 мл (стерильные; вентиляционная крышка с гидрофобной мембраной из ПВДФ 0,22 мкМ) (см. Таблицу материалов) под углом (Рисунок 2D).
ПРИМЕЧАНИЕ: После стерилизации температура питательной среды должна поддерживаться в пределах 65-80 °C, чтобы предотвратить быстрое охлаждение и затвердевание при добавлении зеленого лука или других ингредиентов. Кроме того, в каждую пробирку налейте примерно 10-15 мл рациона. После того, как диеты затвердеют, храните пробирки в холодильнике при температуре 4 °C, если они не используются немедленно.
2. Приобретение аксенических яиц
- Лабораторная система выращивания D. antiqua
- Поместите клетку для выращивания в инкубатор с внутренней светодиодной подсветкой 25 °C (24 часа в цикле, соотношение света и темноты 16:8), чтобы выращивать взрослых самцов и самок, позволяя им спариваться и откладывать яйца. Наполните диспенсер для воды (Рисунок 1B) водой и закройте его смоченной ватой, чтобы обеспечить водой взрослых.
- Поместите четыре дна чашки Петри размером 35 мм x 12 мм в крышку чашки Петри размером 94 мм x 16 мм. Смочите вату ионизированной водой, а затем положите влажную вату на два дна чашки Петри, а поверх ваты добавьте одну столовую ложку сахарозы.
- Наполните дно двух других чашек Петри двумя столовыми ложками сахарозы и дрожжевого экстракта (см. Таблицу материалов), которые служат пищей для взрослых насекомых (рис. 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракт сахарозы и дрожжей, упомянутые в шагах 2.1.2 и 2.1.3, не нуждаются в стерилизации. - Поместите в клетку с мухами дно чашки Петри размером 94 мм x 16 мм, содержащее увлажненный песок и кусочек неукоренившегося, очищенного зубчика чеснока (рис. 1D) для сбора яиц. Самку привлечет запах чеснока, и она будет откладывать вокруг него яйца.
- Сбор яиц
- Выньте из клетки яйцекладку, представляющую собой чашку Петри размером 94 мм x 16 мм, содержащую песок и чеснок, упомянутые выше (шаг 2.14). Насыпьте песок вместе с чесноком в стакан объемом 500 мл и используйте водопроводную воду, чтобы смыть оставшиеся яйца из чеснока в стакан. В этот момент икринки плавают в воде.
- Возьмите сито на 100 меш (см. Таблицу материалов), и смочите его водопроводной водой. Затем вылейте воду с плавающими яйцами из стакана на сито. Яйца останутся на сите.
- После того, как яйца естественным образом высохнут на сите, используйте щетку, чтобы аккуратно смахнуть яйца в чашку Петри.
- В первый день промойте яйцекладку, чтобы собрать яйца без дезинфекции или стерилизации. На второй день в четыре часа дня снова промойте яйца и соберите их, просеивая чистой водой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор яиц на второй день необходимо для обеспечения постоянной скорости роста на последующих стадиях. Четыре часа дня – пик яйцекладки D. antiqua. Таким образом, идеально собирать яйца в это время. - Поместите собранные яйца на стерильное ячеистое сито (см. Таблицу материалов) на сверхчистом столе (Рисунок 3A).
- Приготовьте раствор для стерилизации яиц
- Возьмите 5 мл 5,2% NaClO (см. таблицу материалов) и перелейте в стерилизованную коническую колбу объемом 250 мл. Добавьте 95 мл стерилизованной воды, чтобы получить общий объем 100 мл, в результате чего получится 0,26 % раствора NaClO.
- Для приготовления 75% раствора EtOH берут 75 мл 99,7% EtOH и переносят в стерилизованную коническую колбу объемом 250 мл. Добавьте 25 мл стерилизованной воды, чтобы получить общий объем 100 мл, в результате чего получится 75% раствор EtOH.
- Налейте 30 мл NaClO в чашку Петри и 30 мл EtOH в другую чашку Петри. Поместите ячеистое сито с яйцами, упомянутыми в шаге 2.4, в чашку, содержащую NaClO. Замочите его в 0,26% растворе NaClO на 0,5 мин. Затем переложите сито в чашку, содержащую EtOH, дав ему впитаться в 75% раствор EtOH еще на 0,5 мин.
- Повторите этот процесс три раза, чередуя 0,26% NaClO и 75% EtOH каждые 0,5 мин. После этого будут получены аксенические яйца. На этом этапе сито, содержащее яйца, должно быть погружено в EtOH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить тщательную стерилизацию, используйте пипетку объемом 1 мл для аспирации NaClO и EtOH и диспергирования яиц. Повторите процесс полоскания несколько раз. Этот этап дополнительно очистит поверхность яиц от остаточных бактерий и примесей, обеспечив чистую и стерильную поверхность.
3. Выращивание личинок аксенических пород
- Для переноса стерилизованных яйцеклеток используйте ножницы, стерилизованные спиртовой лампой, чтобы отрезать конечный кончик пипетки объемом 1 мл (рисунок 3B). Следите за тем, чтобы торцевое отверстие разрезанной пипетки было больше, чем диаметр яиц (около 2 мм). Затем с помощью пипетки переложите яйца из раствора EtOH (яйца вместе с раствором) (Рисунок 3C) в центрифужную пробирку, содержащую стерильные рационы, и каждая пробирка должна содержать примерно 20-50 яиц (Рисунок 3D). Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все яйцеклетки не будут перенесены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр наконечника пипетки должен быть как можно больше, чтобы избежать разрыва яйцеклеток во время переноса, что может привести к их гибели. - Используйте пипетку, чтобы удалить излишки этанола из пробирки. Поместите центрифужную пробирку, закрытую крышками, внутрь самогерметизирующегося пакета и положите кусочек ваты в отверстие пакета, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха. Наконец, поместите пакет в инкубатор с температурой 25 °C (относительная влажность: 50%-70%; фотопериод: 16 часов, свет: 8 часов темноты) для наблюдения и выращивания.
- Примерно через три дня начинают вылупляться яйца аксени, включенные в рацион (рис. 4А). Вылупившиеся личинки будут активны, и поверхность стерильных рационов больше не будет гладкой. Личинки начнут питаться кормами.
- Продолжайте наблюдать за личинками до тех пор, пока они не достигнут стадии личинок2-го возраста. Продолжайте следить за их ростом и развитием в этот период.
- Через 9-12 дней более 80% яиц развились в личинок3-го возраста (рис. 4Б). Это свидетельствует об успешном росте и развитии личинок.
4. Валидация личинок аксенических с помощью культурально-зависимых анализов
- Случайным образом выберите из центрифужной пробирки три осевые личинки3-го возраста.
- Поместите личинки в чашку Петри размером 94 мм x 16 мм, содержащую 75% спирта для очистки. После этого переложите их в емкость со стерильной водой для дальнейшего полоскания.
- Используйте продезинфицированные препарирующие щипцы, стерилизованные 75% раствором EtOH, чтобы захватить личинок (голова и хвост показаны на рисунке 5A). С помощью ножниц для препарирования удалите голову и хвост (рисунок 5B). Удерживают хвост личинок щипцами и с помощью других щипцов осторожно сожмите от хвоста к голове и извлеките внутренние органы (результат показан на рисунке 5C). Поместите внутренние органы в деионизированную воду и осторожно вытащите кишечник, надавливая щипцами на жировую ткань, а извлеченные внутренние органы (рис. 5D) поместите в стерильную воду для дальнейшего использования.
- Поместите кишечник в стерильную центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавьте 500 мкл стерилизованного буфера 1x PBS и с помощью одноразового пестика измельчите ткань кишечника в гомогенат.
- Возьмите 100 мкл гомогената и добавьте его в питательную агаровую среду. Используйте Г-образный разбрасыватель (см. Таблицу материалов) для разметки агаровой пластины.
- Поместите чашку Петри в биохимический инкубатор при температуре 28 °C и инкубируйте в течение 72 ч, чтобы наблюдать за ростом колоний.
5. Валидация личинок аксенических с помощью культурально-независимых анализов
- Извлеките общую ДНК из ткани кишечника личинок аксенических растений с помощью набора для экстракции ДНК (см. таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя.
- Измерьте концентрацию ДНК с помощью УФ-спектрофотометра.
- Провести реакцию ПЦР с использованием универсальных бактериальных праймеров 16S рРНК (1492R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT -3', 27F: 5'- AGAGTTTGATCATGGCTCAG -3'). Общий объем реакции составляет 25 мкл и состоит из матрицы ДНК 1 мкл, прямого праймера 0,5 мкл, обратного праймера 0,5 мкл, 10,5 мкл ddH2O и 12,5 мкл 2x Taq PCR Master Mix (см. таблицу материалов). Устанавливают следующие условия реакции ПЦР: начальная денатурация при 94 °С в течение 3 мин; 35 циклов денатурации при 94 °С в течение 30 с, отжига при 55 °С в течение 30 с и растяжения при 72 °С в течение 90 с; окончательное удлинение при 72 °C в течение 10 мин. Храните продукты ПЦР при температуре 4 °C для дальнейшего анализа.
- Проводят реакцию ПЦР с использованием универсальных грибковых праймеров ИТС (ITS1: 5'- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3', ITS4: 5'- TCCTCCGCTTATTGATGATGC -3'). Общий объем реакции составляет 25 мкл и состоит из 1 мкл матрицы ДНК, 0,5 мкл прямого праймера, 0,5 мкл обратного праймера, 10,5 мкл ddH2O и 12,5 мкл 2x Taq PCR Master Mix. Установите условия ПЦР при 95 °C в течение 5 мин; 35 циклов при 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 1 мин и 72 °C в течение 90 с; с последующим 72 °C в течение 10 мин. Храните продукты ПЦР при температуре 4 °C для дальнейшего анализа.
- Используйте краситель нуклеиновой кислоты Super Green (см. Таблицу материалов) для равномерного смешивания с каждым из двух типов продуктов ПЦР и анализируйте их электрофорезом на 1% агарозном геле в буфере 1x TAE (разбавленном из 50x TAE, см. Таблицу материалов). Используйте 3 мкл ДНК-маркера (см. Таблицу материалов) в качестве эталона.
- Используйте УФ-трансиллюминатор для наблюдения за гелем и определения местоположения целевого фрагмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этапы жизни D. antiqua изображены на рисунке 4. Полный жизненный цикл включает яйца, личинки, куколку (рис. 4C) и взрослых особей (рис. 4D). Их культивируют в стерильных центрифужных пробирках, и их внешний вид и выживаемость неотличимы от D. antiqua , выращенных в неаксенических условиях. Время роста и развития каждой стадии D. antiqua можно найти на рисунке 6. Стадия яйца у D. antiqua , выращенной неаксенически, составляет 2,83 ± 0,29 дня, а у аксенически выращенной D. antiqua — 2,83 ± 0,29 дня, без существенной разницы между ними (независимый t-критерий, t = 0,00, p = 1,00). Нормальная личиночная стадия длится 13,83 ± 0,76 дня, в то время как аксеническая личиночная стадия длится 14,50 ± 0,50 дня, без существенной разницы между ними (независимый t-критерий, t = 1,27, p = 0,27). Стадия куколки у нормально выращенного D. antiqua составляет 17,33 ± 0,76 дня, а у аксенически выращенного D. antiqua — 18,00 ± 0,50 дня, без существенной разницы между ними (независимый t-критерий, t = 1,27, p = 0,27). Время выживаемости взрослых особей составляет 81,50 ± 1,00 дня при нормальном выращивании и 80,33 ± 0,76 дня при аксеническом выращивании, без существенной разницы между ними (независимый t-критерий, t = 1,61, p = 0,18). Можно заметить, что существенной разницы во времени развития между аксеническими D. antiqua и теми, которые выращены в нормальных условиях, нет.
Культурально-зависимые анализы показали, что в личиночном кишечнике колоний не обнаружено (рис. 7). Кроме того, ПЦР-анализ на основе бактериальной 16S рРНК выявил наличие полосы на уровне около 1500.н. (рис. 8A), идентифицированной как Wolbachia (номер образца GenBank для этой нуклеотидной последовательности: OR564190), эндосимбиотическая бактерия. Однако при ПЦР-анализе не было выявлено никаких полос, нацеленных на грибковые участки ИТС (рис. 8B). Это свидетельствует о том, что личинки достигли аксенического состояния. Аксенические личинки имеют большое значение для изучения механизмов взаимодействия D. antiqua с микроорганизмами, а также для профилактики и контроля ущерба, наносимого D. antiqua.
Рисунок 1: Приспособления для выращивания и корма для D. antiqua. (А) Белая часть зеленого лука для личинок. (B) Диспенсер для воды для взрослых. (С) Питание для взрослых. (D) Устройство для сбора яиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Компоненты составления рационов. (А) Молотый зеленый лук. (B) Ферментированный зеленый лук. (C) Ферментированный остаток зеленого лука и фильтрат. (D) Подготовленные диеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процесс переноса яйцеклеток. (А) Яйца в ячеистом сите. (B) Пипетка 1 мл без наконечника. (C) 1 мл пипетки с яйцами. (D) Яйца, переведенные на диетические диеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Жизненные стадии аксенического D. antiqua. (А) Яйца. (Б) Личинки. (С) Куколка. (D) Взрослые женщины и мужчины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Процесс вскрытия личиночного кишечника. (А) Голова и хвост личинки. (Б) Личинка с удаленной головой и хвостом. (C) Разделение тканей кишечника и тела. (D) Интактная кишка после вскрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Время развития каждой стадии роста нормально выращенного и аксенически выращенного D. antiqua. Нет существенной разницы во времени развития между аксенически выращенными и нормально выращенными D. antiqua. Независимый t-критерий, p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Подтверждение стерильности D. antiqua путем случайного отбора трех личинок и инкубации кишечных гомогенатов на агаровых планшетах TSA и PDA. У личинок, которых кормили стерильными кормами, бактерий не наблюдалось. (А) Аксенические личинки на TSA. (B) Нормальные личинки на TSA. (C) Аксенические личинки на КПК. (D) Нормальные личинки на КПК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Подтверждение стерильности D. antiqua методом ПЦР-анализа с использованием универсальных праймеров 16S рРНК и праймеров ITS грибов. Полоса-мишень гена 16S рРНК составляет ~1500.н. Полоса около 1500.н. была обнаружена и идентифицирована как эндосимбиотическая бактерия Wolbachia. Полоса-мишень гена ITS составляет 500-750.н. В группах ФП не наблюдалось ни одной целевой полосы. (А) Электроферограмма 16S рРНК. (Б) Электроферограмма ИТС. Сокращения: М = маркер; NC = отрицательный контроль; NF = нормальное кормление; AF = осевая подача. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Насекомые обладают очень сложной микробиотой кишечника20,21, что обуславливает необходимость использования аксенических насекомых, инокулированных специфическими штаммами кишечной микрофлоры, для изучения взаимодействия насекомых и микроорганизмов. Подготовка аксенических насекомых имеет решающее значение для таких исследований. Лечение антибиотиками — это метод, используемый для уничтожения микробиоты кишечника. Например, Юнг и Ким22 кормили Spodoptera exigua пенициллином, в то время как Раймонд23 кормил P. xylostella искусственной диетой, содержащей рифампицин для очищения кишечных бактерий. Однако лечение антибиотиками не может полностью уничтожить кишечные бактерии и имеет множество побочных эффектов для насекомых-хозяев. К ним относятся изменения активности метаболических ферментов, нарушение функции кишечника, угнетение роста, развития и размножения, а также повышенные показатели смертности 23,24,25. Следовательно, функциональность микробиоты кишечника насекомых может быть замаскирована после лечения антибиотиками. К счастью, эту проблему можно решить, химически дезинфицируя поверхность яиц, что позволяет относительно легко производить аксенических насекомых16. Для сравнения, сочетание поверхностной дезинфекции яиц с последующим кормлением стерильными рационами является более эффективным и осуществимым, чем лечение антибиотиками26,27.
Получение аксенического D. antiqua в первую очередь зависит от использования аксенических яиц и стерильных рационов. По сравнению с другими видами насекомых, яйца D. antiqua относительно небольшие. Ранее применявшиеся методы дезинфекции, такие как кратковременное замачивание яиц в 0,1%-ном додецилбензолсульфонате натрия с последующей 5-минутной обработкой 2%-ным раствором перекиси водорода для получения яиц аксенического таракана28 или использование 10%-ного раствора гипохлорита натрия в течение 10 мин для поверхностной дезинфекции яиц красного пальмового долгоносика29, не подходят для дезинфекции D. antiqua Яйца. Существуют предыдущие исследования по дезинфекции яиц видов Diptera, такие как использование растворов перекиси водорода, используемых в качестве дезинфицирующего средства для рук, и перекиси водорода в качестве дезинфицирующего средства для поверхностей для стерилизации яиц Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae)30. Поэтому становится необходимым оптимизировать выбор дезинфицирующего средства и время дезинфекции. После экспериментов было обнаружено, что использование 0,26% NaClO и 75% EtOH, дезинфекция яиц в течение 0,5 мин и повторение процесса три раза позволяют добиться стерилизации яиц D. antiqua .
После получения аксенических яиц еще одним важным аспектом выращивания аксенических D. antiqua является обеспечение их стерильными рационами для личинок in vitro. Несмотря на то, что искусственные диеты не могут полностью воспроизвести натуральную пищу, исследования 31,32,33 продемонстрировали возможность выращивания насекомых с использованием искусственных диет. Содержание питательных веществ в искусственных рационах может влиять на иммунную систему и приспособляемость насекомых34. Поэтому важно, чтобы искусственно приготовленные рационы содержали питательные компоненты, аналогичные натуральной пище. Это поможет обеспечить выращенных насекомых необходимыми питательными веществами для своего развития, иммунного ответа и общего состояния здоровья. В этом исследовании зеленый лук служит основным компонентом стерильных рационов для D. antiqua. Полуферментированные диеты обеспечивают D. antiqua лучшими питательными веществами, способствуя их росту и развитию. Кроме того, смешивание гомогената личинок с рационами направлено на облегчение предварительного переваривания рациона микробиотой кишечника вне организма. Это связано с тем, что кишечные бактерии оказывают влияние на питание и пищеварение насекомых35. Использование этого метода для приготовления стерильных рационов для D. antiqua упрощает процесс и значительно повышает эффективность составления диеты.
Бактериальные симбионты, передаваемые по материнской линии внутри клеток, широко представлены у насекомых36. Вольбахия, внутриклеточная бактерия, передаваемая по материнской линии, присутствует у многочисленных насекомых37. Вольбахия наиболее известна своей ролью в репродуктивных манипуляциях, поскольку она может смещать соотношение полов потомства хозяина в сторону производства большего количестваинфицированных самок. После проверки аксенического состояния личинок D. antiqua было установлено, что личинки после дезинфекции были по существу аксеническими, за исключением эндосимбиотических бактерий Wolbachia, присутствующих в цитоплазме клеток ткани яичников у D. antiqua и передающихся вертикально из поколения в поколение через цитоплазму яйцеклеток. Что касается метода устранения вольбахии, то лечение антибиотиками является распространенным подходом. Таким образом, в данной статье представлен способ выращивания аксенического D. antiqua. Согласно протоколу, аксеническую D. antiqua можно успешно разводить. Кроме того, этот метод отличается простотой и низкой стоимостью, что обеспечивает новый подход к выращиванию других аксенических насекомых и повышает возможность изучения взаимодействия между насекомыми и микробиотой кишечника.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32272530), проектом «Новые двадцать стратегий для университетов в Цзинане» (2021GXRC040), крупными проектами научно-технических инноваций в провинции Шаньдун (2021TZXD002) и Проектом интеграции науки и образования Технологического университета Цилу (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
References
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods in Molecular Biology. 1438, 123-135 (2016).
- Douglas, A. E. Multiorganismal insects: diversity and function of resident microorganisms. Annual Review of Entomology. 60 (1), 17-34 (2015).
- Wang, G. -H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219 (2022).
- Nishide, Y., et al. Aseptic rearing procedure for the stinkbug Plautia stali (Hemiptera: Pentatomidae) by sterilizing food-derived bacterial contaminants. Applied Entomology and Zoology. 52 (3), 407-415 (2017).
- Ma, M., Liu, P., Yu, J., Han, R., Xu, L. Preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle. Journal of Visualized Experiments. 176, e63195 (2021).
- Zhu, Z., Wang, D., Liu, Y., Tang, T., Wang, G. H. Optimizing the rearing procedure of germ-free wasps. Journal of Visualized Experiments. 197, e65292 (2023).
- Somerville, J., Zhou, L. Q., Raymond, B. Aseptic rearing and infection with gut bacteria improve the fitness of transgenic diamondback moth, Plutella xylostella. Insects. 10 (4), 89 (2019).
- Shuoying, N., Jiufeng, W., Jinian, F., Hugo, R. Predicting the current potential and future world wide distribution of the onion maggot, Delia antiqua using maximum entropy ecological niche modeling. PLoS ONE. 12 (2), e0171190 (2017).
- Ellis, P. R., Eckenrode, C. J. Factors influencing resistance in Allium sp. to onion maggot. Bulletin of the Entomological Society of America. 25 (2), 151-154 (1979).
- Nault, B. A., Straub, R. W., Taylor, A. G. Performance of novel insecticide seed treatments for managing onion maggot (Diptera : Anthomyiidae) in onion fields. Crop Protection. 25 (1), 58-65 (2006).
- Leach, A., Reiners, S., Fuchs, M., Nault, B. Evaluating integrated pest management tactics for onion thrips and pathogens they transmit to onion. Agriculture Ecosystems & Environment. 250, 89-101 (2017).
- Zhou, F., et al. Bacterial Inhibition on Beauveria bassiana Contributes to Microbiota Stability in Delia antiqua. Frontiers in Microbiology. 12, 710800 (2021).
- Zhou, F., et al. Symbiotic bacterium-derived organic acids protect delia antiqua larvae from entomopathogenic fungal infection. mSystems. 5 (6), 00778-00820 (2020).
- Jing, T. Z., Qi, F. H., Wang, Z. Y. Most dominant roles of insect gut bacteria: digestion, detoxification, or essential nutrient provision. Microbiome. 8 (1), 38 (2020).
- Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. Generating germ-free drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions. Current Protocols in Toxicology. 77 (1), e52 (2018).
- Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402 (2018).
- Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).
- Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions. Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).
- Ma, M., et al. Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels. Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).
- Zhang, W., et al. Differences between microbial communities of pinus species having differing level of resistance to the pine wood nematode. Microbial Ecology. 84 (4), 1245-1255 (2022).
- Jung, S., Kim, Y. Synergistic effect of Xenorhabdus nematophila K1 and Bacillus thuringiensis subsp aizawai against Spodoptera exigua (Lepidoptera : Noctuidae). Biological Control. 39 (2), 201-209 (2006).
- Raymond, B., et al. A mid-gut microbiota is not required for the pathogenicity of Bacillus thuringiensis to diamondback moth larvae. Environmental Microbiology. 11 (10), 2556-2563 (2009).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Y. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
- Llop, P., Latorre, A., Moya, A. Experimental epidemiology of antibiotic resistance: looking for an appropriate animal model system. Microbiology Spectrum. 6 (1), (2018).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The use of peracetic acid to obtain germfree invertebrate eggs for gnotobiotic studies. American Midland Naturalist. 6 (1), 239 (1963).
- Dillon, R., Charnley, K. Mutualism between the desert locust Schistocerca gregaria and its gut microbiota. Research in Microbiology. 153 (8), 503-509 (2002).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen affects gut bacterial colonization and metabolic activities in a gnotobiotic cockroach model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y. M., Shi, Z. H. Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies. Bio-Protocol. 9 (24), e3456 (2019).
- Bavani, M. M., et al. Sterilization of Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae) Eggs for maggot debridement therapy. Journal of Medical Entomology. 59 (3), 1076-1080 (2022).
- Han, L. Z., Li, S. B., Liu, P. L., Peng, Y. F., Hou, M. L. New artificial diet for continuous rearing of Chilo suppressalis (Lepidoptera: Crambidae). Annals of the Entomological Society of America. 105 (2), 253-258 (2012).
- Bezerra, C. E. S., Amaral, B. B., Souza, B. Rearing Chrysoperla externa larvae on artificial diets. Neotropical Entomology. 46 (1), 93-99 (2017).
- Feng, H. Q., Jin, Y. L., Li, G. P., Feng, H. Y. Establishment of an artificial diet for successive rearing of Apolygus lucorum (Hemiptera: Miridae). Journal of Economic Entomology. 105 (6), 1921-1928 (2012).
- Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. J. Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae. Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).
- Li, X. Y., et al. Dynamics of the intestinal bacterial community in black soldier fly larval guts and its influence on insect growth and development. Insect Science. 30 (4), 947-963 (2023).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and Evolution of heritable bacterial symbionts. Annual Review of Genetics. 42, 165-190 (2008).
- Weinert, L. A., Araujo-Jnr, E. V., Ahmed, M. Z., Welch, J. J. The incidence of bacterial endosymbionts in terrestrial arthropods. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 282 (1807), 20150249 (2015).
- Weeks, A. R., Turelli, M., Harcombe, W. R., Reynolds, K. T., Hoffmann, A. A. From parasite to mutualist: Rapid evolution of Wolbachia in natural populations of Drosophila. PLOS Biology. 5 (5), 997-1005 (2007).
