Summary
Her beskriver vi en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode til storskala produktion af endosomafledte nanovesikler som en ny type exosomefterligninger (EM'er), der deler samme biologiske oprindelse og lignende struktur, morfologi og proteinsammensætning af native ekstracellulære vesikler (EV'er).
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) har tiltrukket sig betydelig opmærksomhed i fysiologisk og patologisk forskning, sygdomsdiagnose og behandling; Deres kliniske oversættelse har imidlertid været begrænset af manglen på opskaleringsfremstillingsmetoder. Derfor tilvejebringer denne protokol en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode til storskala produktion af endosomafledte nanovesikler som en ny type exosomefterligninger (EM'er) afledt af endosomerne, som har ca. 100 gange højere udbytte end konventionel ultracentrifugeringsmetode. I denne metode blev magnetiske nanopartikler (MNP'er) internaliseret af forældreceller via endocytose og blev efterfølgende akkumuleret i deres endosomer. Derefter blev MNP-belastede endosomer opsamlet og renset ved hypotonisk behandling og magnetisk adskillelse. En højhastighedshomogenisator blev brugt til at bryde MNP-belastede endosomer i monodisperse nanovesikler. De resulterende endosomafledte vesikler har samme biologiske oprindelse og struktur, kendetegnet ved nanopartikelsporingsanalyse, transmissionselektronmikroskop og western blotting. Deres morfologi og proteinsammensætning ligner native EV'er, hvilket indikerer, at EM'er potentielt kan tjene som en billig og højtydende surrogat af native EV'er til kliniske oversættelser.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er små vesikler udskilt af næsten alle celler med et størrelsesområde på 30-150 nm, der indeholder rigelige bioaktive stoffer. Afhængigt af oprindelsescellen viser EV'er høj heterogenitet og besidder flere komponenter, der er specifikke for moderceller1. EV'er frigives i kropsvæsker og transporteres til fjerne steder, hvor de optages af målceller til handling2, som kan bruges til at levere en bred vifte af bioaktive molekyler og lægemidler til vævsreparation, tumordiagnose og -behandling og immunmodulation 3,4. Imidlertid påvirker andre biologiske nanopartikler (f.eks. lipoproteiner) og nanovesikler (f.eks. EV'er afledt af ikke-endosomale veje) med lignende biofysiske egenskaber i kropsvæsker uundgåeligt EV-isolering og oprensning. Til dato forbliver ultracentrifugering guldstandarden for EV-isolering, og andre isolationsmetoder, herunder centrifugering af saccharosedensitetsgradient, ultrafiltrering, polyethylenglycoludfældning, kromatografi og immunomagnetisk perleisolering, er blevet udviklet5. Den nuværende flaskehals, der begrænser klinisk oversættelse og kommercialisering af EV-terapi, er den alvorlige mangel på isolationsteknikker, der muliggør meget skalerbar og reproducerbar isolering af EV'er 6,7,8. Traditionelle EV-isolationsteknikker (f.eks. ultracentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi) lider under lavt udbytte (1 x 107-1 x 108/1 x 10 6 celler), lang produktionscyklus (24-48 timer), dårlig reproducerbarhed af produktkvalitet og kræver dyrt og energiintensivt produktionsudstyr, der ikke kan imødekomme den nuværende kliniske efterspørgsel efter elbiler6.
Exosomefterligninger (EM'er), syntetiske surrogater af indfødte elbiler, har tiltrukket sig vigtig opmærksomhed på grund af deres meget lignende struktur, funktion og skalerbarhed i produktionen. Hovedkilden til EM'er er fra direkte ekstrudering af hele forældreceller med kontinuerlig sektionering9,10, hvilket demonstrerer potente biologiske funktioner som native EV'er11,12. For eksempel udøver EM'er afledt af humane navlesnorsmesenkymale stamceller (hUCMSC'er) lignende sårhelende virkninger som indfødte EV'er og er rigere på proteinsammensætning13. Selvom EM'er afledt af hele celler har den biologiske kompleksitet af EV'er, er deres største ulempe heterogeniteten af produkter, fordi de uundgåeligt er forurenet af forskellige cellulære organeller og celleaffald. Proteinlokaliseringsanalyse afslørede yderligere, at EM'er afledt af helcelleekstrudering indeholder mange ikke-EVs-specifikke proteiner fra mitokondrier og det endoplasmatiske retikulum13. Desuden kræver de fleste metoder til fremstilling af EM'er stadig ultracentrifugering, en meget tidskrævende og energiforbrugende proces14. I betragtning af det faktum, at exosomer udelukkende stammer fra cellulære endosomer, antog vi, at biomanipulerede endosomafledte nanovesikler bedre kan rekapitulere den biologiske homologi mellem exosomer og EM'er sammenlignet med de veletablerede cellemembranafledte EM'er produceret ved helcelleekstruderingsmetode14. Ikke desto mindre er fremstillingen af nanovesikler afledt af endosom vanskelig på grund af manglen på levedygtige tilgange.
Kliniske undersøgelser er blevet udført ved at bruge EV'er som en surrogat af cellefri terapi og et nanoskala lægemiddelafgivelsessystem til behandling af forskellige sygdomme. For eksempel er elbiler afledt af mesenkymale stamceller fra knoglemarv blevet brugt til behandling af alvorlig lungebetændelse forårsaget af COVID-19 og har opnået lovende resultater. For nylig har genetisk manipulerede elbiler, der bærer CD24-proteiner, også vist potente terapeutiske fordele til behandling af COVID-19-patienter15,16. Imidlertid kan det kliniske krav til EV-terapi stadig ikke opfyldes med traditionelle isolationsmetoder på grund af det lave udbytte og omkostninger. Denne undersøgelse rapporterer storskala produktion af endosomafledte nanovesikler via en magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogeniseringsmetode. Det udnytter endocytosevejen for MNP'er til at isolere MNP-belastede endosomer via magnetisk adskillelse efterfulgt af højhastighedshomogenisering for at formulere endosomer i monodisperse nanovesikler. Da de typer endosomer, der indsamles af denne protokol, er forskellige, er der stadig behov for yderligere dybdegående forskning for at etablere god fremstillingspraksis (GMP) i branchen. Denne nye EM-forberedelsesmetode er mere tidseffektiv (5 minutters højhastighedshomogenisering) for at opnå nanovesikler, der er homologe med native EV'er. Det producerer eksponentielt flere vesikler fra de samme mængder celler end ultracentrifugering, som generelt kan anvendes på forskellige celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Et skema over metoden er vist i figur 1.
1. EM-forberedelse og isolering
- Celleinternalisering af MNP'er
- Cellekultur
- Suspender 1 × 106 mesenkymale stamceller fra knoglemarv hos rotter (BMSC), 293T-celler eller musens ovarieepitelcancerceller (ID8) i DMEM komplet medium med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 5% penicillin-streptomycinopløsning (P / S) i 2 ml pr. Seks-brøndplade (se materialetabel).
- Dyrk cellerne natten over ved 37 °C og 5% CO2.
BEMÆRK: Antallet af celler efter vedhæftning var ca. 1 × 106.
- Endocytose af MNP'er
- Reducer mellemvolumenet af hver seksbrøndsplade til 1 ml. Co-kultur cellerne med 10 nm polylysinmodificerede jernoxidnanopartikler (IONP'er) (se materialetabel) i en koncentration på 100 μg/1 × 106 celler og inkuberes ved 37 °C i en atmosfære indeholdende 5% CO2 i 12 timer for at give cellerne mulighed for at endocytose IONP'er fuldt ud.
- Cellekultur
- Isolering og homogenisering af endosomer
- Cellehypotonisk behandling
- Fordøje cellerne, der har fuldt internaliserede IONP'er med 0,5 ml / brøndtrypsin i 3 minutter, og afslut fordøjelsen ved at tilføje 1 ml / godt komplet medium.
- Der centrifugeres ved 1000 x g i 5 min, og supernatanten kasseres. Resuspender cellerne i fosfatbuffersaltvand (PBS) og centrifuger gentagne gange for at vaske restmediet og uabsorberede IONP'er ud.
- Til sidst resuspenderes pelleten i 8 ml i forberedt hypotonisk opløsning (71,4 mM kaliumchlorid, 1,3 mM natriumcitrat, pH 7,2-7,4) i 15 minutter (se materialetabel).
- Frigivelse af organeller ved homogenisering ved lav hastighed
- Cellesuspensionen overføres i hypotonisk opløsning til et glas reagensglas og frigøres organellerne ved hjælp af en glashomogenisator (se materialetabel) med 20 stød ved 1000 o / min.
- Magnetisk adskillelse for at opnå endosomer
- Overfør 1 ml af den homogeniserede celleopløsning til et 1,5 ml mikrocentrifugerør og anbring det i en magnetisk separator i 1 time for fuldt ud at adskille IONP-belastede endosomer fra andre organeller (såsom kerne og mitokondrier) og celleaffald.
- Opsaml de brune pellets på kontaktfladen af mikrocentrifugerørene ved siden af magnetrammen (se materialetabellen), dvs. de IONP-belastede endosomer. Kassér væsken i mikrocentrifugeglassene og tilsæt 3 ml PBS for at resuspendere endosomerne.
- Cellehypotonisk behandling
- Homogenisering med høj hastighed
- Opløsningen indeholdende endosomerne overføres til et 15 ml centrifugerør med et væskevolumen mellem 3-10 ml.
- Højhastighedshomogenisatorens 10 mm sonde (se materialetabel) forlænges til bunden af centrifugerøret uden at røre bunden. Juster knappen Hastighed under skærmen, indstil hastigheden til 140 x g, og juster knappen Tid for at indstille tiden på 5 min, og tryk derefter på knappen OK.
- Tryk på Start-knappen for at udføre homogeniseringen efter placering af en isboks under prøven.
- Magnetisk sortering til EM'er
- Opløsningen indeholdende nanovesikler opnået ved højhastighedshomogenisering overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerøret og anbringes i en magnetisk separator i 1 time.
- Opsaml væsken, der indeholder de krævede EM'er. Pas på ikke at røre overfladen af rørene ved siden af magnetrammen, som adsorberede frie IONP'er og IONP-belastede EM'er.
2. EM-karakterisering (figur 2 og figur 3)
- Dynamisk lysspredning (DLS) analyse
- Injicer 1 ml EMs-prøve (20 μg/ml) langs væggen i kuvetten, og placer den i instrumentprøveåbningen på DLS-instrumentet (se materialetabel).
- Åbn DLS-softwaren, vælg Partikelstørrelsestest, og start testen.
- Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af et BCA-proteinanalysesæt (se materialetabel).
- Nanopartikelsporingsanalyse (NTA)
- Fortynd EM'er med PBS til en opløsning ved 1 × 107-1 × 108 partikler/ml og injicer dem i NTA-instrumentets kammer (se materialetabellen) ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en strømningshastighed på 500-1000 μL/min.
- Åbn de 488 laserkanaler, og sørg for, at antallet af EM'er i softwaregrænsefladen er inden for 100-300 og i brunsk bevægelse.
- I henhold til producentens protokol skal du vælge den relevante SOP (EV-488) for at sikre, at instrumentets følsomhed er egnet til EM-detektion.
- Transmissionselektronmikroskopi (TEM)
- Fix EM'er (1 mg / ml) med et lige volumen på 5% glutaraldehyd i 30 minutter, og kvantificer koncentrationen af EM'er som 1 mg / ml ved BCA-proteinanalysesæt.
- Anbring en dråbe EM på 10 μL på kulstofsiden af kobbernettet, og fjern overskydende væske fra siden med filterpapir efter 10 minutter. Der tilsættes 10 μL PBS, og der fyldes straks med filtrerpapir. Gentag to gange for at fjerne overskydende glutaraldehyd.
- Slip 5 μL uranylacetat kontrastmiddel og pletter negativt i 1 min, fjern derefter det overskydende kontrastmiddel. Vask tre gange med deioniseret vand og tør ved stuetemperatur (RT).
- Optag billede med en TEM ved en accelerationsspænding på 100 kV.
- Western blotting
- Der tilsættes 100 μL cellelysebuffer og 5 μL af en 50x proteasehæmmercocktail til prøverne (se materialetabel). Bland forsigtigt med en pipettepistol og læg på is i 30 minutter.
- Opløsningen centrifugeres ved 1000 x g i 10 minutter ved 4 °C, supernatantens proteinkoncentration kvantificeres med et BCA-proteinanalysesæt, og den opsamles.
- 100 μL supernatanten blandes med 25 μL 5x proteinpåfyldningsbuffer og opvarmes ved 95 °C i 10 min.
- Forbered geler i henhold til instruktionerne fra de præformerede geler. Der fyldes 15 μg protein pr. brønd og køres ved gelelektroforese ved 80 V. Vent på, at prøven løber til separationsgelen, skift til 100 V, og overfør derefter proteinet til en nitrocellulosemembran ved 100 V, 60 minutter under isbad.
- Detekter de ikke-EV-specifikke markører (Calnexin) og EV-biomarkører (Annexin og CD63) ved western blotting (se materialetabel).
BEMÆRK: Antistofferne fortyndes i henhold til producentens anbefalinger.
3. Påvisning af in vitro EM-funktion
- EMs mærkning
- Bland 1 μL PKH26 med 250 μL fortyndingsmiddel C (1:250) for at fremstille 2x farvningsopløsning (4 × 10-6 M) (se materialetabel).
- Bland 250 μL EM'er (1 mg/ml) med 250 μL 2x farvningsopløsning, og blæs hurtigt med en pipetteringspistol.
- Inkuber ved RT i 2-5 minutter, mens centrifugeglasset forsigtigt vendes.
- Tilsæt et tilsvarende volumen serum eller 1% bovint serumprotein og inkuber i 1 min for at afslutte fordøjelsen.
- Fjern overskydende PKH26 ved ultrafiltrering med 1000 KD ultrafiltreringsrør ved 3000 x g i 30 minutter, og gentag tre gange ved tilsætning af PBS. Resuspender den resterende væske til 500 μL med PBS og filtrer gennem et 0,22 μm filter.
- Analyse af celleoptagelse
- Cellepodning: Frø 1 × 106 celler i 35 mm konfokale skåle med 1 ml DMEM indeholdende 10% FBS og 5% P / S og inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
- Filtrer EM'erne med 0,22 μm sterile sprøjtefiltre for at fjerne potentiel forurening.
- Behandl cellerne med PKH26-mærkede EM'er (10,9 partikler/ml) i 8 timer.
- Vask tre gange med PBS, tilsæt DAPI (10 ng/ml), og inkuber i 10 minutter ved RT.
- Hent fluorescensbillederne i konfokal laserscanning fluorescensmikroskopi ved hjælp af 405 nm og 561 nm laserkanaler (se materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsprocessen for EM-forberedelse ved magnetisk separationsassisteret højhastighedshomogenisering er vist i figur 1. Celler internaliserer 10 nm polylysinmodificerede IONP'er, som specifikt akkumuleres i endosomer via endocytose (figur 3A). Efter behandling med hypotonisk buffer og homogeniseret frigives de IONP-belastede endosomer fra cellerne og opsamles efterfølgende ved magnetisk adskillelse. De isolerede endosomer rekonstitueres yderligere til monodisperse nanovesikler, også kendt som EM'er, ved højhastighedshomogenisering. Vi undersøgte flere nøgleparametre (f.eks. homogeniseringshastighed og tid) for at identificere optimerede EM-forberedelsesbetingelser (figur 2). Endelig blev en homogeniseringshastighed på 140 x g i 5 minutter valgt som den optimerede tilstand ved at overveje partikelstørrelsen og udbyttet af producerede EM'er. Frie IONP'er og IONP-belastede EM'er fjernes til sidst fra den endelige produktopløsning ved en anden runde magnetisk adskillelse for at opnå IONP-fri EM'er. Metoden producerer meget ensartede og monodispergerede nanovesikler fra forældrecelleendosomer, der deler samme biologiske oprindelse som indfødte elbiler.
For at sammenligne elbiler opnået ved ultracentrifugering med EM'er genereret ved denne metode blev BMSC og 293T forberedt til elbiler og EM'er. Diameteren og morfologien af EM'er blev analyseret af NTA og TEM. Morfologien af BMSC-EM'er har træk ved en typisk skålformet vesikellignende struktur og er afgrænset af et lipiddobbeltlag (figur 3A). Som analyseret af NTA har både BMSC-EM'er og 293T-EM'er en lignende hydrodynamisk diameter som native EV'er (BMSC-EV'er og 293T-EV'er) (figur 3B). BMSC-EMs udbytter af højhastighedshomogenisering var 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 celler, og udbyttet af native EV'er fremstillet ved ultracentrifugering var kun 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106celler. Tilsvarende var 293T-EMs udbytter af højhastighedshomogenisering 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 celler, hvilket når op til ca. 100 gange højere end dem for native 293T-EV'er fremstillet ved den konventionelle ultracentrifugemetode (≈5,5 × 10 6/1 × 10 6celler) (figur 4A).
Desuden viste western blotting-resultater, at BMSC-EM'er indeholder de samme proteinbiomarkører som EV'er (CD63 og Annexin). Både EM'er og EV'er er negative for Calnexin-ekspression, hvilket tyder på, at EM'er produceret ved denne metode næsten ikke havde nogen plasmamembrankontaminering (figur 3C). Der er ingen signifikant forskel i proteinkoncentration mellem EM og EV, BMSC-EM'er og BMSC-EV'er udviste lignende samlede proteinkoncentrationer, 11,15 μg/1 × 10 9 partikler og 14,71 μg/1 × 109 partikler via BCA-proteinanalysesættet. Desuden udviste 293T-EM'er og 293T-EV'er samlede proteinkoncentrationer på henholdsvis ca. 31,8 μg/1 × 10 9 partikler og 9,95 μg/1 × 109 partikler (figur 4B). Disse resultater indikerer, at EM'er har en lignende proteinsammensætning som native EV'er. For at detektere, om EM'er kan endocytoseres, blev PKH26-mærkede EM'er og EV'er co-inkuberet med BMSC og ID8 i en koncentration på 1 × 109 partikler / ml i 8 timer, og cellerne blev observeret under konfokal fluorescensmikroskopi for at bekræfte, at EM'er let kunne optages af cellerne til handling såvel som EV'er (figur 5).
Figur 1: Skematisk diagram over den magnetisk assisterede højhastighedshomogeniseringsmetode. Trin 1: Celler internaliserer IONP'er i endosomer gennem endocytose. Trin 2: Saml organeller, herunder IONP-belastede endosomer, efter hypotonisk behandling og homogenisering. Trin 3: Rens IONP-belastede endosomer ved magnetisk adskillelse. Trin 4: Endosomerne homogeniseres og rekonstitueres til monodisperse nanovesikler. Trin 5: Fjern frie IONP'er og IONP-belastede EM'er ved magnetisk adskillelse for at indsamle IONP-fri EM'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Optimering af EM-forberedelsesbetingelser . (A) Diameteren og PDI for BMSC-EM'er som reaktion på homogeniseringshastighedsændringer, når tiden er indstillet til 5 min, blev analyseret af DLS. (B) Diameteren og PDI for BMSC-EM'er som reaktion på homogeniseringstidsændringer, når homogeniseringshastigheden er indstillet til 140 x g , blev analyseret af DLS. (C) Diameteren og PDI for BMSC-EM'er på forskellige lagringstidspunkter blev analyseret af DLS. (D) Diameteren og koncentrationen af BMSC-EM'er som reaktion på homogeniseringshastighedsændringer, når tiden er indstillet til 5 minutter, blev analyseret af NTA. (E) Diameteren og koncentrationen af BMSC-EM'er som reaktion på homogeniseringstidsændringen, når homogeniseringshastigheden er indstillet til 140 x g , blev analyseret af NTA. (F) Diameteren og udbyttet af BMSC-EM'er som reaktion på BMSC-cellers co-inkubation med IONP'er i forskellige koncentrationer blev analyseret af NTA. p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Karakterisering af EM'er . (A) TEM-karakterisering af forældrecellernes morfologi med endocytoserede IONP'er, endosomer og EM'er. Skalastængerne repræsenterer 500 nm. (B) Hydrodynamiske diametre af BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM og 293T-EV er kendetegnet ved NTA. (C) Western blot-analyseresultater af BMSC-EM'er, BMSC-EV'er og BMSC-cellelysater. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Udbyttet af EM'er er højere end elbiler. (A) Udbyttet af EM'er og elbiler fremstillet ud fra BMSC og 293T blev analyseret af NTA. (B) Proteinindhold i EM og EV'er fremstillet af BMSC og 293T. **p < 0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative fluorescerende mikroskopbilleder af PKH26-mærkede elbiler og EM'er internaliseret af BMSC og ID8. Skalabjælkerne repræsenterer 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som et surrogat for cellefri terapi og et nanoskala lægemiddelafgivelsessystem har elbiler endnu ikke opfyldt deres kliniske forventninger, og en hovedhindring er manglen på skalerbare og reproducerbare produktions- og oprensningsmetoder6. Derfor er forskellige typer EM'er blevet udviklet som EV-analoger med lignende biologisk kompleksitet14. Til dato er det mest almindeligt anvendte EM-eksempel celleplasmamembranafledte nanovesikler. Fremstillingen af sådanne nanovesikler er forholdsvis let og ligetil ved direkte ekstrudering af hele moderceller17. Imidlertid kan nanovesikler afledt af celleplasmamembraner ikke rekapitulere native EV'er på grund af to ulemper: For det første er den biologiske oprindelse af disse nanovesikler fra celleplasmamembran, som indeholder forskellige lipid- og proteinsammensætninger sammenlignet med native EV'er; For det andet forureningerne, herunder proteiner, nukleinsyrer og lipider fra ikke-EV-organeller og celleaffald, hvilket forårsager uundgåelig EM-heterogenitet. I denne metode inkuberede vi celler med IONP'er og indsamlede IONP-belastede endosomer gennem magnetisk adskillelse, genererede derefter monodisperse nanovesikler via højhastighedshomogenisering og opnåede til sidst IONP-fri EM'er ved en anden runde magnetisk adskillelse. Desuden optimerede vi EM-forberedelsesbetingelserne ved at undersøge virkningen af forskellige parametre, såsom homogeniseringshastighed og tid, på EM-størrelse og udbytte. Denne protokol udnytter et interessant biologisk fænomen: MNP'er (f.eks. 10 nm IONP'er) kan effektivt internaliseres af næsten alle celler via endocytose og udelukkende akkumuleres i endosomer, ikke andre organeller. Denne unikke biologiske proces muliggjorde isolering af MNP-belastede endosomer uden ikke-EV-kontaminering via magnetisk adskillelse. Til gengæld kunne nanovesikler fremstillet af disse oprensede celleendosomer mere trofast rekapitulere den biologiske kompleksitet af indfødte elbiler.
Desuden er den gyldne standard for EV-isoleringsmetoden ultracentrifugering, som koster massive cellekulturmedier og en lang behandlingstid på over 5 timer og kun producerer 1 × 107-1 × 108 partikler fra 1 x 10 6 celler6. Traditionelle helforældrecelleekstruderingsmetoder omfatter flere trin, der involverer ultrahøjtryksmembranekstrudering og ultracentrifugering, som har et relativt højere udbytte, men kræver dyrt udstyr17. EM-produktionsudbyttet, effektiviteten, omkostningerne og arbejdskraften forbedres dog væsentligt ved at udnytte vores protokol. Højhastighedshomogenisatoren er et almindeligt og billigt udstyr til en kort behandlingstid på 5 minutter i denne protokol, og denne metode kan producere op til 100 gange flere EM'er fra 1 × 106 celler sammenlignet med native EV'er. Denne metode har imidlertid nogle begrænsninger, såsom tab af endosomale proteiner under højhastighedshomogenisering, og det har vist sig, at MNP'er endocytoseret af celler kan overføres til lysosomer, hvilket ville være en potentiel forurening18.
I perspektiv kan EM'er konstrueres til at udøve vigtige biologiske funktioner som deres oprindelige kolleger, hvilket kan tjene som en ny og lovende type biologisk terapi. Bioaktive stoffer (f.eks. proteiner og nukleinsyrer) kan integreres i EM'er via udvælgelse af specifikke forældreceller (f.eks. stamceller19) eller genetisk modifikation (f.eks. fusionsproteiner20). F.eks. har celleafledte nanovesikler ved ekstrudering af levende embryonale stamceller en positiv effekt på genopretnings- eller sårhelingsprocessen19. Gensplejsning er en alternativ tilgang til at generere EM'er med specifikke biologiske funktioner. For eksempel, når celler blev transfekteret med vektorer af antiepidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) nanobodies fusioneret til glycosylphosphatidylinositol (GPI) ankersignalpeptider, kan EGFR-nanobodies forankres på overfladen af EV'er til målretning af EGFR-ekspressive tumorceller20. EM'er har fungeret godt som en surrogat for cellefri terapi og et nanoskala lægemiddelafgivelsessystem i flere prækliniske undersøgelser14, men der mangler en omfattende mekanistisk forståelse af EM eller EV-baseret terapi med bekymringer om heterogeniteten og reproducerbarheden af EV'er og EM'er i kliniske undersøgelser. Samlet set berettiger EM'ernes biologiske funktioner og deres kliniske implikationer yderligere undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D.W. og P.G. er medopfindere af en patentansøgning indgivet af Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Den anden forfatter erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender brugen af instrumenter på Shared Instrumentation Core Facility ved Institute of Basic Medicine and Cancer (IBMC), Chinese Academy of Sciences. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (NSFC; 82172598), Natural Science Foundation of Zhejiang Province, Kina (LZ22H310001), 551 Health Talent Training Project of Health Commission of Zhejiang Province, Kina, Agricultural and Social Development Research Project of Hangzhou Municipal Science and Technology Bureau (2022ZDSJ0474) og Qiantang Interdisciplinary Research Grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al.
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
