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Biology

लागत प्रभावी ट्रांसक्रिप्टोमिक-आधारित ड्रग स्क्रीनिंग

Published: February 23, 2024 doi: 10.3791/65930
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 1,3,4, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1Systems Medicine, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV., 2Genomics & Immunoregulation, LIMES Institute, University of Bonn, 3PRECISE Platform for Single Cell Genomics and Epigenomics, DZNE and University of Bonn, 4Immunogenomics & Neurodegeneration, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV.

Summary

यह प्रोटोकॉल पूर्व विवो या इन विट्रो सेल संस्कृतियों से लागत प्रभावी ट्रांसक्रिप्टोम-आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा प्री-प्रोसेसिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।

Abstract

ट्रांसक्रिप्टोमिक्स सेलुलर कार्यक्रमों में व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और गड़बड़ी के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं की अनुमति देता है। पिछले दशक में पुस्तकालय उत्पादन और अनुक्रमण की लागत में उल्लेखनीय कमी के बावजूद, दवा स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक पैमाने पर इन तकनीकों को लागू करना निषेधात्मक रूप से महंगा है, इन तरीकों की अपार क्षमता में बाधा डालता है। हमारा अध्ययन ट्रांसक्रिप्टोम-आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक लागत प्रभावी प्रणाली प्रस्तुत करता है, जो मिनी-बल्क ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के साथ लघु गड़बड़ी संस्कृतियों का संयोजन करता है। अनुकूलित मिनी-बल्क प्रोटोकॉल लागत प्रभावी अनुक्रमण गहराई पर सूचनात्मक जैविक संकेत प्रदान करता है, जिससे ज्ञात दवाओं और नए अणुओं की व्यापक जांच सक्षम होती है। चुने हुए उपचार और इनक्यूबेशन समय के आधार पर, इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप लगभग 2 दिनों के भीतर पुस्तकालयों को अनुक्रमित किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के भीतर कई रोक बिंदुओं के कारण, पुस्तकालय की तैयारी, साथ ही अनुक्रमण, समय-स्वतंत्र रूप से किया जा सकता है। एक साथ प्रसंस्करण नमूनों की एक बड़ी संख्या संभव है; डेटा गुणवत्ता के नुकसान के बिना 384 नमूनों तक के माप का परीक्षण किया गया था। इष्टतम दवा इनक्यूबेशन समय में परिवर्तनशीलता पर विचार करने के बावजूद, स्थितियों और / या दवाओं की संख्या के लिए कोई ज्ञात सीमाएं नहीं हैं।

Introduction

नई दवाओं का विकास एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है जिसमें संभावित दवाओं और उनके लक्ष्यों की पहचान करना, दवा उम्मीदवारों को अनुकूलित और संश्लेषित करना और प्रीक्लिनिकल औरनैदानिक परीक्षणों में उनकी प्रभावकारिता और सुरक्षा का परीक्षण करना शामिल है। दवा स्क्रीनिंग के लिए पारंपरिक तरीकों, यानी, चिकित्सीय प्रयोजनों के लिए उम्मीदवार यौगिकों के पुस्तकालयों के व्यवस्थित मूल्यांकन, विशिष्ट लक्ष्यों या मार्गों पर प्रभाव का परीक्षण करने के लिए पशु मॉडल या सेल आधारित assays का उपयोग शामिल है. हालांकि ये विधियां दवा उम्मीदवारों की पहचान करने में सफल रही हैं, लेकिन वे अक्सर दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता और संभावित दुष्प्रभावों के तंत्र के अंतर्निहित जटिल आणविक तंत्र में पर्याप्त अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं।

जीनोम-वाइड ट्रांसक्रिप्शनल राज्यों का आकलन दवा स्क्रीनिंग में वर्तमान सीमाओं को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है, क्योंकि यह दवा उपचार2 के जवाब में जीन अभिव्यक्ति के व्यापक आकलन को सक्षम बनाता है। एक निश्चित समय में व्यक्त एक जीनोम-वाइड फैशन में आरएनए टेप को मापने से, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उद्देश्य जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, वैकल्पिक स्प्लिसिंग और गैर-कोडिंग आरएनए अभिव्यक्ति3 में परिवर्तन सहित दवाओं के जवाब में होने वाले ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तनों का समग्र दृष्टिकोण प्रदान करना है। इस जानकारी का उपयोग दवा के लक्ष्यों को निर्धारित करने, दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने और दवा की खुराक और उपचार के नियमों को अनुकूलित करने के लिए किया जा सकता है।

निष्पक्ष दवा स्क्रीनिंग के साथ ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के संयोजन के प्रमुख लाभों में से एक नए दवा लक्ष्यों की पहचान करने की क्षमता है जिन्हें पहले नहीं माना गया है। पारंपरिक दवा स्क्रीनिंग दृष्टिकोण अक्सर स्थापित लक्ष्य अणुओं या मार्गों पर ध्यान केंद्रित करते हैं, नए लक्ष्यों की पहचान में बाधा डालते हैं और संभावित रूप से अप्रत्याशित दुष्प्रभावों और प्रतिबंधित प्रभावशीलता वाली दवाओं के परिणामस्वरूप होते हैं। ट्रांसक्रिप्टोमिक्स दवा उपचार के जवाब में होने वाले आणविक परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करके इन सीमाओं को दूर कर सकता है, संभावित लक्ष्यों या मार्गों को उजागर कर सकता है जिन्हें पहले2 नहीं माना जा सकता था।

नए दवा लक्ष्यों की पहचान के अलावा, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता की भविष्यवाणी करने के लिए भी किया जा सकता है। दवा प्रतिक्रियाओं से जुड़े जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का विश्लेषण करके, बायोमार्कर विकसित किए जा सकते हैं जिनका उपयोग किसी विशेष दवा या उपचार के लिए रोगी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है। यह दवा की खुराक को अनुकूलित करने और प्रतिकूल दुष्प्रभावों के जोखिम को कम करने में भी मदद करसकता है।

इसके संभावित लाभों के बावजूद, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की लागत दवा स्क्रीनिंग में इसके व्यापक अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा बनी हुई है। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए विशेष उपकरण, तकनीकी विशेषज्ञता और डेटा विश्लेषण की आवश्यकता होती है, जो दवा स्क्रीनिंग में ट्रांसक्रिप्टोमिक्स का उपयोग करने के लिए सीमित धन वाले छोटे शोध टीमों या संगठनों के लिए चुनौतीपूर्ण बना सकता है। हालांकि, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स की लागत लगातार कम हो रही है, जिससे यह अनुसंधान समुदायों के लिए अधिक सुलभ हो गया है। इसके अतिरिक्त, प्रौद्योगिकी और डेटा विश्लेषण विधियों में प्रगति ने ट्रांसक्रिप्टोमिक्स को अधिक कुशल और लागत प्रभावी बना दिया है, जिससे इसकी पहुंचबढ़ गई है 2.

इस प्रोटोकॉल में, हम प्रतिलेख आधारित दवा स्क्रीनिंग के लिए एक उच्च आयामी और खोजपूर्ण प्रणाली का वर्णन, मिनी थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विश्लेषण 5,6 के साथ miniaturbation गड़बड़ी संस्कृतियों के संयोजन. इस प्रोटोकॉल के साथ, पूर्ण लंबाई वाले एमआरएनए अनुक्रमण के लिए वाणिज्यिक समाधानों की वर्तमान लागत के प्रति नमूना लागत को 1/6वें तक कम करना संभव है। प्रोटोकॉल के लिए केवल मानक प्रयोगशाला उपकरण की आवश्यकता होती है, एकमात्र अपवाद लघु-पठन अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों का उपयोग होता है, जिसे आउटसोर्स किया जा सकता है यदि अनुक्रमण उपकरण घर में उपलब्ध नहीं हैं। अनुकूलित मिनी-बल्क प्रोटोकॉल लागत प्रभावी अनुक्रमण गहराई पर सूचना-समृद्ध जैविक संकेत प्रदान करता है, जिससे ज्ञात दवाओं और नए अणुओं की व्यापक जांच सक्षम होती है।

प्रयोग का उद्देश्य विभिन्न जैविक संदर्भों में पीबीएमसी पर दवा गतिविधि के लिए स्क्रीन करना है। इस प्रोटोकॉल को किसी भी जैविक प्रश्न पर लागू किया जा सकता है जहां कई दवाओं को एक ट्रांसक्रिप्टोमिक रीडआउट के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए, जिससे उपचार के सेलुलर प्रभाव का एक प्रतिलेख-विस्तृत दृश्य दिया जा सके।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल बॉन विश्वविद्यालय की स्थानीय नैतिकता समितियों के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. बफर, समाधान और उपकरण तैयार करना

  1. समाधान तैयार करें और सामग्री की तालिका में वर्णित सामग्रियों को इकट्ठा करें।
  2. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें और पूर्ण विकास माध्यम (आरपीएमआई-1640 + 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) को गर्म करें।
  3. सेल कटाई के लिए, बर्फ-ठंडा फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग करें।
    नोट: बाँझपन बनाए रखने के लिए कोशिकाओं के साथ काम करते समय एक स्वच्छ वातावरण रखें।

2. सेल हैंडलिंग

नोट: मानव रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) के क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल7 में पाया जा सकता है।

  1. सेल विगलन और गिनती
    1. तरल नाइट्रोजन से cryovials निकालें और उन्हें 2 - 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में पिघलना जबकि धीरे inverting.
    2. पिघली हुई कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. क्रायोवियल को 1 एमएल गर्म पूर्ण विकास माध्यम से कुल्ला और इस समाधान को ट्यूब में कोशिकाओं में ड्रॉपवाइज जोड़ें (1सेंट कमजोर पड़ने वाला कदम)।
    4. 32 एमएल (क्रमशः 1, 2, 4, 8, और गर्म पूर्ण विकास माध्यम के 16 एमएल के साथ कुल 5 कमजोर पड़ने) की मात्रा तक पहुंचने तक कमजोर पड़ने 1: 1 दोहराएं। शंक्वाकार ट्यूब को थोड़ा उत्तेजित करते हुए सेल की गड़बड़ी को कम करने के लिए मध्यम ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    5. 5 मिन (300 x ग्राम, 20 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र करें और धीरे से एक धाराप्रवाह गति में शंक्वाकार ट्यूब को टिप करके सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    6. गर्म पूर्ण विकास माध्यम के 3 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और सेल गिनती के साथ आगे बढ़ें।
    7. गिनती के लिए, गिनती करते समय मृत कोशिकाओं से जीवित अंतर करने के लिए ट्रिपैन ब्लू (सेल निलंबन के घनत्व के आधार पर 1: 2 से 1:10 कमजोर पड़ने) के साथ सेल निलंबन के 10 माइक्रोन मिलाएं। डाई के तेज होने के कारण मृत या क्षतिग्रस्त कोशिकाएं नीली दिखाई देंगी, जबकि महत्वपूर्ण कोशिकाएं दागदार नहीं होती हैं।
      नोट: ट्रिपैन ब्लू थोड़ा साइटोटॉक्सिक है, सना हुआ कोशिकाओं को 5 मिनट से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए।
    8. सना हुआ सेल समाधान के 10 माइक्रोन का उपयोग करके या तो एक स्वचालित सेल काउंटर या गिनती कक्ष के साथ कोशिकाओं की गणना करें।
      1. Neubauer बेहतर सेल कक्ष का उपयोग करते समय, कोनों पर स्थित चार बड़े वर्गों के भीतर सभी कोशिकाओं की गिनती और सेल निलंबन की एकाग्रता की गणना करने के लिए निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करें.
        Equation 1
    9. गर्म पूर्ण विकास माध्यम के साथ कोशिकाओं को 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। अपकेंद्रित्र केवल अगर आवश्यक मात्रा 3 एमएल से कम है और सही मात्रा में सेल गोली resuspended है.
  2. सेल सीडिंग और उपचार
    1. बीज 100 एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (1 एक्स 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) में अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के माइक्रोन.
      नोट: सीडिंग के लिए सेल नंबर पीबीएमसी संस्कृतियों के लिए अनुकूलित किया गया था। जबकि कम सेल सांद्रता अनुक्रमण के लिए आरएनए की पर्याप्त मात्रा में उपज नहीं होगी, कोशिकाओं की एक अत्यधिक संख्या suboptimal सेल lysis और रिवर्स प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के निषेध के जोखिम में वृद्धि होगी.
    2. उपचार के लिए उपयोग किए जाने वाले दो गुना एकाग्रता में दवा कमजोर पड़ने की तैयारी करें (2x)। यौगिक की घुलनशीलता के अनुसार विलायक चुनें, अधिमानतः पूर्ण विकास माध्यम।
      नोट: पीबीएस या डाइमिथाइल सल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) का उपयोग किया जा सकता है यदि पर्याप्त घुलनशीलता अन्यथा नहीं पहुंच सकती है। विलायक द्वारा प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी को रोकने के लिए परिणामी इनक्यूबेशन मात्रा में डीएमएसओ की अधिकतम एकाग्रता 0.5% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
    3. 2x दवा कमजोर पड़ने (अच्छी तरह से 1X में अंतिम एकाग्रता) के 100 माइक्रोन जोड़ें और परिभाषित समय के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: समय के इनक्यूबेशन इष्टतम दवा स्थापित करने और साइटोटॉक्सिसिटी के संभावित तंत्र को बाहर करने के लिए पूरक जांच की जानी चाहिए।
  3. सेल कटाई और lysis
    1. 10 मिनट (300 x ग्राम, 20 डिग्री सेल्सियस) के लिए सेल संस्कृति प्लेट अपकेंद्रित्र. धीरे एक वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें, एक कोण (30 डिग्री -45 डिग्री) पर प्लेट रखते हुए, जबकि अच्छी तरह से के रूप में कम कोशिकाओं को हटाने के लिए अच्छी तरह से कम कोने पर टिप लक्ष्य.
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से बर्फ ठंड पीबीएस के 200 माइक्रोन जोड़कर कोशिकाओं को धो लें और 5 मिनट (300 x ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए प्लेट अपकेंद्रित्र करें। एक वैक्यूम पंप के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, फिर से, जितना संभव हो उतना पीबीएस को हटाने के लिए एक तेज कोण पर थाली रखते हुए.
    3. लाइसिस बफर तैयार करें जैसा कि आवश्यक प्रतिक्रियाओं (आरएक्सएन) की संख्या के लिए तालिका 1 में वर्णित है, 10% ओवरएज जोड़कर।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से lysis बफर के 15 माइक्रोन जोड़ें और संदूषण के खिलाफ नमूनों की रक्षा के लिए चिपकने वाला सील फिल्म के साथ प्लेट सील. भंवर 1 मिनट (1000 x ग्राम, 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए centrifuging से पहले थाली और बर्फ पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
    5. एक पीसीआर प्लेट में lysed सेल समाधान के 6 माइक्रोन लीजिए और जल्द ही इष्टतम सेल lysis सुनिश्चित करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate फ्रीज. प्लेटों के कई ठंड चक्रों से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: रोक बिंदु: सीडीएनए उत्पादन बाद में बाहर नहीं किया जाता है, सेल लाइसेट शाही सेना की गुणवत्ता में काफी कमी के बिना कई महीनों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

3. अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी

  1. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) प्रतिक्रिया
    नोट: आरएनए के साथ काम करते समय, सभी नमूनों को बर्फ पर रखें और न्यूक्लीज-मुक्त उपकरण (बाँझ, डिस्पोजेबल प्लास्टिकवेयर) और पानी का उपयोग करना सुनिश्चित करें।
    1. आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार के रूप में आवश्यक प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए तालिका 2 में वर्णित है, 10% ओवरएज जोड़ने. संक्षेप में मिश्रण भंवर और शीघ्र ही यह नीचे स्पिन. उपयोग होने तक मिश्रण को बर्फ पर रखें।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर सेल lysate पिघलना और संक्षेप में यह नीचे स्पिन थाली के तल पर सभी सेल lysate इकट्ठा करने के लिए.
    3. तालिका 3 के अनुसार एक थर्मोसाइक्लर पर एमआरएनए विकृतीकरण करें।
    4. प्लेट को थर्मोसाइकिलर से बाहर निकालें और संभावित घनीभूत इकट्ठा करने के लिए शीघ्र ही इसे नीचे स्पिन करें। 12 माइक्रोन की अंतिम मात्रा के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से आरटी प्रतिक्रिया मिश्रण के 6 माइक्रोन जोड़ें प्लेट की रक्षा के लिए और वाष्पीकरण, भंवर से बचने के लिए, और इसे नीचे स्पिन करने के लिए प्लेट को सील करें।
    5. थर्मोसाइक्लर पर प्लेट रखें और तालिका 3 के अनुसार आरटी प्रतिक्रिया कार्यक्रम शुरू करें।
  2. पूर्व प्रवर्धन
    1. कमरे के तापमान पर उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ और इन-सीटू पीसीआर (आईएसपीसीआर) प्राइमर को पिघलाएं।
    2. आवश्यक प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए तालिका 4 के अनुसार पूर्व-प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें, 10% ओवरएज जोड़ें। संक्षेप में मिश्रण भंवर और यह नीचे स्पिन.
      नोट: एंजाइम मिश्रण कमरे के तापमान पर घंटों तक स्थिर रहता है।
    3. पीसीआर प्लेट नीचे स्पिन, प्रत्येक अच्छी तरह से पूर्व प्रवर्धन मिश्रण के 15 माइक्रोन जोड़ें और थाली सील.
    4. इसे थर्मोसाइक्लर पर रखें और तालिका 5 के अनुसार पूर्व-प्रवर्धन प्रतिक्रिया शुरू करें।
      1. आरएनए सामग्री के कारण चक्रों की संख्या समायोजित करें। कम संख्या से शुरू करें और सीडीएनए उपज पर्याप्त नहीं होने पर बढ़ाएं।
        नोट: हमारे अनुभव में, प्रत्येक सेल प्रकार के लिए चक्रों की इष्टतम संख्या स्थापित की जानी चाहिए, प्रयोगात्मक स्थिति और उपचार चक्रों की इष्टतम संख्या को प्रभावित नहीं करेगा। इसलिए, हम एक नए सेल प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल की स्थापना करते समय प्रयोगात्मक रूप से चक्रों की इष्टतम संख्या स्थापित करने की सलाह देते हैं। सामान्य तौर पर, प्राथमिक कोशिकाओं को सेल लाइनों की तुलना में अधिक संख्या में चक्रों की आवश्यकता होगी। रोक बिंदु: पूर्व प्रवर्धन उत्पाद पर संग्रहीत किया जा सकता है - 20 डिग्री सेल्सियस.
  3. सीडीएनए क्लीन-अप और गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी)
    नोट: नमूना सफाई प्रत्येक थाली के लिए क्रमिक प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में नमूने नहीं बल्कि इस स्तर पर स्थिर हैं. नमूनों की संख्या बढ़ाने से प्रोटोकॉल की लंबी अवधि हो जाएगी, लेकिन नमूनों की संख्या को सीमित नहीं किया जाएगा जिन्हें एक साथ संसाधित किया जा सकता है।
    1. शुरू करने से पहले, पूरी तरह से मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 1 मिनट के लिए उच्च गति पर कमरे के तापमान और भंवर के लिए चुंबकीय शुद्धि मोती लाओ।
    2. प्रत्येक कुएं में 0.8x v/v (20 μL) चुंबकीय शुद्धि मोती जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. मोती पूरी तरह से अलग कर रहे हैं जब तक 5 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर पीसीआर प्लेट रखें. सतह पर तैरनेवाला सावधानी से निकालें.
    4. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखते हुए, मोतियों को धोने और 30 एस के लिए इनक्यूबेट करने के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 100 माइक्रोन को धीरे से जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए एक छोटी मात्रा विंदुक का प्रयोग करें. एक अतिरिक्त धोने के कदम के लिए दोहराएं। जितना संभव हो उतना इथेनॉल निकालना सुनिश्चित करें।
    5. हवा 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय रैक पर मोती सूखी जब तक इथेनॉल पूरी तरह से वाष्पित हो जाता है और मोती अब चमकदार नहीं लग रही है.
    6. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें, न्यूक्लीज मुक्त पानी के 20 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें और 2 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. थाली चुंबकीय रैक पर फिर से रखें जब तक मोती अलग कर रहे हैं.
    8. सीडीएनए क्यूसी और टैगमेंटेशन के लिए एक नई पीसीआर प्लेट में एल्यूट को पुनर्प्राप्त करें।
    9. सीडीएनए पुस्तकालय के आकार, वितरण और एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए एक टेपस्टेशन या फ्रैगमेंट विश्लेषक परख करें (अनुशंसित: टेपस्टेशन डी 5000 परख)। विवरण के लिए, निर्माता निर्देश देखें। 20 एनजी की एक विशिष्ट उपज की उम्मीद की जानी है।
  4. किट के साथ टैगमेंटेशन
    नोट: पहले से स्थापित होने पर अन्य टैगमेंटेशन प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है।
    1. सीडीएनए को न्यूक्लीज मुक्त पानी का उपयोग करके 150 - 300 पीजी/माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता में पतला करें।
    2. एंजाइम मिश्रण में सीडीएनए जोड़ने के बाद टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया की तत्काल शुरुआत सुनिश्चित करने के लिए तालिका 6 के अनुसार थर्मोसाइक्लर को प्रीप्रोग्राम करें।
    3. आवश्यक प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए तालिका 7 के अनुसार टैगमेंटेशन मिश्रण तैयार करें, 10% ओवरएज जोड़ें।
    4. एक नई पीसीआर प्लेट पर टैगमेंटेशन मिश्रण प्रति प्रतिक्रिया के 3 माइक्रोन वितरित करें और प्रत्येक प्रतिक्रिया में सीडीएनए के 1 माइक्रोन जोड़ें।
    5. सीडीएनए जोड़ने के तुरंत बाद टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया शुरू करें।
    6. टैगमेंट बफर को बेअसर करने के 1 माइक्रोन जोड़कर प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करें (एनटी; वैकल्पिक रूप से, 0.2% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का उपयोग किया जा सकता है)।
  5. संवर्धन पीसीआर
    1. प्रतिक्रियाओं की संख्या के लिए संवर्धन पीसीआर मिश्रण तालिका 7 तैयार करें, 10% ओवरएज जोड़ना। (अनुशंसित: Nextera UDI पैटर्न प्रवाह कोशिकाओं (जैसे, Illumina NovaSeq 6000) पर सूचकांक hopping को रोकने के लिए सेट).
    2. 14 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए प्रत्येक प्रतिक्रिया में संवर्धन पीसीआर मिश्रण के 9 माइक्रोन जोड़ें।
    3. तालिका 8 के अनुसार संवर्धन पीसीआर कार्यक्रम चलाएं।
      नोट: संवर्धन पीसीआर के लिए, 16 चक्र मानक हैं। यदि सीडीएनए की गुणवत्ता खराब है, तो अतिरिक्त चक्र जोड़े जा सकते हैं।
  6. सफाई और क्यूसी
    1. शुरू करने से पहले, पूरी तरह से मोतियों को फिर से निलंबित करने के लिए 1 मिनट के लिए उच्च गति पर कमरे के तापमान और भंवर के लिए चुंबकीय शुद्धि मोती लाओ।
    2. 1.0x v/v (14 μL) चुंबकीय शुद्धि मोती जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि मोती पूरी तरह से अलग न हो जाएं। सतह पर तैरनेवाला सावधानी से निकालें.
    4. प्लेट को चुंबकीय रैक पर रखते हुए, मोतियों को धोने और 30 एस के लिए इनक्यूबेट करने के लिए हौसले से तैयार 80% इथेनॉल के 100 माइक्रोन को धीरे से जोड़ें। सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए एक छोटी मात्रा विंदुक का प्रयोग करें. एक अतिरिक्त धोने के कदम के लिए दोहराएं। जितना संभव हो उतना इथेनॉल निकालना सुनिश्चित करें।
    5. मोतियों को कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए हवा में सुखाएं या जब तक वे चमकदार न दिखें।
    6. चुंबकीय रैक से प्लेट निकालें, न्यूक्लीज मुक्त पानी के 20 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें और 2 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
    7. थाली चुंबकीय रैक पर फिर से रखें जब तक मोती अलग और पुस्तकालय QC के लिए एक नई पीसीआर प्लेट में eluate पुनर्प्राप्त.
    8. सीडीएनए पुस्तकालय के आकार, वितरण और एकाग्रता का मूल्यांकन करने के लिए एक टेपस्टेशन या टुकड़ा विश्लेषक परख करें (अनुशंसित: टेपस्टेशन डी 1000 उच्च संवेदनशीलता परख)। विवरण के लिए, निर्माता निर्देश देखें। औसतन, 10 एनजी की उपज की उम्मीद की जानी है।
      नोट: स्टॉपिंग पॉइंट: पीसीआर उत्पाद को - 20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

4. अनुक्रमण और डेटा पूर्व प्रसंस्करण

  1. अनुक्रमण
    नोट: निम्नलिखित दिशानिर्देश लघु-पठन अनुक्रमण के लिए सभी इलुमिना उपकरणों पर लागू होंगे। यदि इंस्ट्रूमेंटेशन उपलब्ध नहीं है, तो अनुक्रमण बाहरी अनुक्रमण सुविधा द्वारा किया जा सकता है। अन्य अनुक्रमण दृष्टिकोण भी इस्तेमाल किया जा सकता है. सादगी के लिए, हमने केवल सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अनुक्रमण तकनीक पर रिपोर्ट करना चुना।
    नोट: सॉफ़्टवेयर उपयोग से संबंधित निम्न चरण Illumina NovaSeq6000 sequencer पर प्रक्रिया का वर्णन करते हैं।
    1. चरण 3.6.8 में प्राप्त परिणामों के अनुसार एक समतुल्य अनुपात में पूल विशिष्ट अनुक्रमित पुस्तकालय।
    2. नमूना मोलरिटी की गणना करने के लिए एक उच्च संवेदनशीलता परख के साथ अंतिम पूल की एकाग्रता को निम्नानुसार मापें:
      Equation 2
    3. साधन के विनिर्देश के अनुसार और प्रयोगात्मक अनुकूलन के लिए प्रवाह सेल लोड. आम उपकरणों की सांद्रता लोड करने के लिए उदाहरण तालिका 9 में दिखाए गए हैं।
    4. स्क्रीन को छूकर, रन सेटअप आरंभ करने के लिए अनुक्रम का चयन करें।
    5. स्क्रीन और लोड फ्लो सेल, अनुक्रम-दर-संश्लेषण कारतूस, क्लस्टरिंग कारतूस, बफर कारतूस पर दिए गए निर्देशों का पालन करें और सुनिश्चित करें कि अपशिष्ट कंटेनर खाली हैं।
    6. एक बार सभी अभिकर्मकों साधन द्वारा मान्यता प्राप्त किया गया है रन सेटअप पर क्लिक करें. डेटा को स्टोर करने के लिए रन नाम और आउटपुट फ़ोल्डर को यहां परिभाषित करें।
    7. अनुक्रमण विवरण को 51 बीपी के दोनों रीड्स के साथ युग्मित-अंत के रूप में परिभाषित करें। दो इंडेक्स रीड्स भी 8 बीपी प्रत्येक के साथ अनुक्रमित होते हैं।
    8. प्रेस समीक्षा और यह जांचने के बाद कि क्या सभी अनुक्रमण विवरण सही हैं , स्टार्ट रन दबाएं।
      नोट: अनुशंसित अनुक्रमण गहराई 5 x 106 पढ़ता है/नमूना है, न्यूनतम 1 x 106 पढ़ता है/नमूना के साथ।
  2. डेटा प्री-प्रोसेसिंग
    1. कच्चे अनुक्रमण डेटा को FASTQ प्रारूप में बदलें और उपकरण Bcl2Fastq2 के साथ नमूना अनुक्रमित के अनुसार डिमल्टीप्लेक्स करें। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ डीमल्टीप्लेक्सिंग करें। Bcl2Fastq2 पर विस्तृत निर्देशों के लिए, संदर्भ पुस्तिका देखें।
      नोट: FASTQ रूपांतरण और डिमल्टीप्लेक्सिंग आमतौर पर अनुक्रमण सुविधा द्वारा की जाती है यदि अनुक्रमण घर में नहीं किया जाता है। अनुक्रमण सुविधाएं आमतौर पर आगे की प्रक्रिया के लिए डीमल्टीप्लेक्स फास्टक्यू प्रदान करेंगी।
    2. डेटा संरेखण और अनुक्रमण पढ़ने की बहुतायत मात्रा का ठहराव के लिए कई विकल्प उपलब्ध हैं (अनुशंसित: एनएफ-कोर आरएनए-सीक्यू पाइपलाइन (https://nf-co.re/rnaseq))। पाइपलाइन कई विकल्प प्रदान करती है, प्रतिलेख बहुतायत को निर्धारित करने के लिए स्टार8 के साथ गठबंधन और सैल्मन9 के साथ डिफ़ॉल्ट सेटिंग का उपयोग करें।
    3. नोट: आगे जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण के लिए, कई तरीके उपलब्ध हैं। यह सभी को कवर करने के लिए इस प्रोटोकॉल के दायरे में नहीं है (अनुशंसित: DEseq2 पाइपलाइन10)। हमारे द्वारा विकसित DEseq2 वर्कफ़्लो पर आधारित एक मानक स्क्रिप्ट GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) पर पाई जा सकती है।

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Representative Results

रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल के बाद, मानव पीबीएमसी को वरीयता दी गई, विभिन्न इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं के साथ इलाज किया गया और, अलग-अलग इनक्यूबेशन समय के बाद, अनुक्रमण प्रोटोकॉल(चित्रा 1)का उपयोग करके थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए काटा गया।

आदर्श दवा सांद्रता और परीक्षण यौगिकों के लिए इनक्यूबेशन बार पूरक प्रयोगात्मक रणनीतियों की मदद से और विशिष्ट वैज्ञानिक प्रश्न के आधार पर इस प्रोटोकॉल को ऊपर की ओर पहचाना जाना चाहिए। ज्यादातर मामलों में, 2 - 4 घंटे और 24 घंटे इनक्यूबेशन उपचार के लिए प्रारंभिक और देर से ट्रांसक्रिप्शनल प्रतिक्रियाओं का प्रतिनिधित्व प्रदान करना चाहिए।

प्रोटोकॉल के सही निष्पादन का मूल्यांकन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण परिणाम सीडीएनए और पुस्तकालय क्यूसी(चित्रा 2 और चित्रा 3)हैं। सीडीएनए प्रोफाइल में > 1000 बीपी(चित्रा 2)के औसत आकार के साथ एक व्यापक वितरण होना चाहिए, कम औसत आकार या कम आणविक भार(चित्रा 4)पर अणुओं का संचय कम आरएनए इनपुट या आरएनए गिरावट का संकेत दे सकता है।

एक अच्छा अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी भी प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है; पोस्ट-टैगमेंटेशन पुस्तकालयों में लगभग 250 बीपी (चित्रा 3) का एक संकीर्ण वितरण होना चाहिए; अब टुकड़े अनुक्रमण (चित्रा 5) के दौरान खराब प्रदर्शन करेंगे.

अनुक्रमण के बाद, कच्ची FASTQ फाइलें उपयुक्त संदर्भ जीनोम (जैसे, मानव या माउस) के खिलाफ संरेखित होती हैं और प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिलेख बहुतायत की मात्रा निर्धारित की जाती है (एनएफ-कोर आरएनए-सीक्यू पाइपलाइन (https://nf-co.re/rnaseq) देखें)। डेटा की समग्र गुणवत्ता की जांच करने के लिए अब खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण किया जाएगा। संरेखित डेटा प्रोटीन कोडिंग जीन की एक उच्च संख्या पर कब्जा करना चाहिए क्योंकि केवल पाली एडेनाइलेटेड आरएनए को इस प्रोटोकॉल(चित्रा 6ए)के साथ कब्जा कर लिया जाएगा। मानव नमूनों में हम 15000 और 20000 प्रतिलेखों के बीच कब्जा करने की उम्मीद करते हैं (यह मान जेनकोड 27 संदर्भ मानव जीनोम एनोटेशन11 पर आधारित है)। इसके अलावा खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण में प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) शामिल हो सकता है। यहां, डेटा की अंतर्निहित संरचना को दो-आयामी साजिश में देखा जा सकता है। चित्रा 6 बी में, हम एक अनुकरणीय पीसीए साजिश दिखाते हैं; यहां डॉट्स उपचार द्वारा रंगीन होते हैं, जो प्रयोगात्मक स्थितियों के तीन अलग-अलग समूहों को दिखाते हैं जो समान ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल के लिए अग्रणी होते हैं। यहां यह भी देखा जा सकता है कि जैविक प्रतिकृतियां (एक ही रंग के साथ डॉट्स) ट्रांसक्रिप्शनल रूप से समान हैं, जो प्रोटोकॉल की अच्छी मजबूती दिखाते हैं। इस आंकड़े में दिखाए गए परिणाम DESeq2 वर्कफ़्लो (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2) के आधार पर GitHub पर उपलब्ध पाइपलाइन के साथ उत्पन्न हुए थे।

Figure 1
चित्रा 1: समय अनुमान और कार्यप्रवाह। (ए) 96 नमूनों के साथ एक रन के लिए इस प्रोटोकॉल का समय अनुमान। (बी) डेटा पूर्व प्रसंस्करण तक कोशिकाओं विगलन से प्रोटोकॉल के भीतर प्रत्येक कदम का आरेख. आरेख को तीरों के बाद ऊपर से नीचे तक पढ़ा जाना चाहिए। गोलाकार तीर कदम की पुनरावृत्ति का वर्णन करते हैं। लाल डॉट्स प्रोटोकॉल में आगे वर्णित रोक बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीडीएनए पुस्तकालयों के लिए अनुकरणीय परिणाम। एक लघु वैद्युतकणसंचलन के परिणाम अनुकरणीय सीडीएनए पुस्तकालय के आकार वितरण दिखा रहा है. ऊपरी और निचले सिग्नल नमूने को संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों का प्रतिनिधित्व करते हैं। नीली रेखाएं औसत टुकड़े के आकार (नीले कोष्ठक) को इंगित करती हैं। सीडीएनए प्रोफाइल > 1000 बीपी के औसत आकार के साथ एक व्यापक वितरण दिखाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए अनुकरणीय परिणाम। एक छोटे से छोटे वैद्युतकणसंचलन के परिणाम एक संकीर्ण वितरण और लगभग 250 बीपी के औसत आकार के साथ सफलतापूर्वक तैयार अनुक्रमण पुस्तकालयों के आकार वितरण को दिखाते हैं। ऊपरी और निचले सिग्नल नमूने को संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों का प्रतिनिधित्व करते हैं। नीली रेखाएं औसत टुकड़े के आकार (नीले कोष्ठक) को इंगित करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: सीडीएनए पुस्तकालयों के लिए अनुकरणीय उप-इष्टतम परिणाम। एक लघु वैद्युतकणसंचलन के परिणाम 200 बीपी के औसत आकार के साथ एक उप-इष्टतम सीडीएनए पुस्तकालय के आकार वितरण को दिखाते <। ऊपरी और निचले सिग्नल नमूने को संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों का प्रतिनिधित्व करते हैं। नीली रेखाएं औसत टुकड़े के आकार (नीले कोष्ठक) को इंगित करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अनुक्रमण पुस्तकालयों के लिए अनुकरणीय उप-इष्टतम परिणाम। एक लघु वैद्युतकणसंचलन के परिणाम 200 - 1000 बीपी के लंबे टुकड़े वाले एक उप-इष्टतम अनुक्रमण पुस्तकालय के आकार वितरण को दिखाते हैं। ऊपरी और निचले सिग्नल नमूने को संरेखित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों का प्रतिनिधित्व करते हैं। नीली रेखाएं औसत टुकड़े के आकार (नीले कोष्ठक) को इंगित करती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण। खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण के प्रतिनिधि परिणाम पीबीएमसी पर चयनित इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं के प्रभाव को दिखाते हैं। (ए) जीन प्रकार (एक्स-अक्षों) द्वारा अलग किए गए जीन (वाई-अक्षों) की संख्या का बार ग्राफ। (बी) विभिन्न दवा उपचारों द्वारा रंगीन डेटासेट में सभी जीनों का पीसीए। एक ही रंग वाले डॉट्स जैविक प्रतिकृति हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) एकाग्रता आयतन [μL] /rxn
गुआनिडाइन हाइड्रोक्लोराइड 80 मिमी 7.50
डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (dNTPs) 10 मिमी प्रत्येक 6.52
स्मार्ट dT30VN प्राइमर 100 माइक्रोन 0.33
न्यूक्लियस मुक्त पानी 0.65
कुल मात्रा 15.00

तालिका 1: लाइसिस बफर।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन [μL] /rxn
SSRT II बफर (5x) 2.00
डीटीटी (100 मिमी) 0.50
बीटाइन (5 मीटर) 2.00
एमजीसीएल2 (1 एम) 0.14
एसएसआरटी II (200 यू/μL) 0.25
RNAse अवरोधक (40 U/μL) 0.25
टीएसओ-एलएनए (100 माइक्रोन) 0.20
न्यूक्लियस मुक्त पानी 0.66
कुल मात्रा 6.00

तालिका 2: रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) प्रतिक्रिया मिश्रण।

एमआरएनए विकृतीकरण
कहीं जाना तापमान मियाद
एमआरएनए विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिन
बर्फ पर 2 मिन
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन
कहीं जाना तापमान मियाद
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन 42 डिग्री सेल्सियस 90 मिण्ट
एंजाइम निष्क्रियता 70 डिग्री सेल्सियस 15 मिण्ट
4 डिग्री सेल्सियस पकड

तालिका 3: एमआरएनए विकृतीकरण और रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (आरटी) के लिए थर्मोसाइक्लर कार्यक्रम।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन [μL] /rxn
उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 12.50
आईएसपीसीआर प्राइमर (10 माइक्रोन) 0.15
न्यूक्लियस मुक्त पानी 2.35
कुल मात्रा 15.00

तालिका 4: पूर्व प्रवर्धन मिश्रण.

सीढ़ी तापमान मियाद
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 3 मिन
विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 20 है 16 - 18 चक्र
एनीलिंग 67 डिग्री सेल्सियस 20 है
विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 6 मिन
4 डिग्री सेल्सियस पकड

तालिका 5: पूर्व प्रवर्धन थर्मोसाइक्लर कार्यक्रम।

सीढ़ी तापमान मियाद
टैगमेंटेशन 55 डिग्री सेल्सियस 8 मिन
4 डिग्री सेल्सियस पकड

तालिका 6: टैगमेंटेशन थर्मोसाइक्लर प्रोग्राम।

टैगमेंटेशन मिक्स
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन [μL] /rxn
एम्प्लिकॉन टैगमेंट मिक्स (एटीएम) 1.0
टैगमेंट डीएनए बफर (टीडी) 2.0
कुल मात्रा 3.0
संवर्धन पीसीआर मिश्रण
अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन [μL] /rxn
उच्च-निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ 7.0
Nextera-संगत अनुक्रमण प्राइमर 2.0
कुल मात्रा 9.0

तालिका 7: टैगमेंटेशन मिश्रण और संवर्धन पीसीआर मिश्रण।

सीढ़ी तापमान मियाद
हॉट स्टार्ट 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
प्रारंभिक विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 30 एस
विकृतीकरण 98 डिग्री सेल्सियस 10 एस 16 चक्र
एनीलिंग 60 डिग्री सेल्सियस 30 एस
विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिन
4 डिग्री सेल्सियस पकड

तालिका 8: संवर्धन पीसीआर थर्मोसाइक्लर कार्यक्रम।

साधन एकाग्रता लोड हो रहा है
MiSeq v2 10 बजे
नेक्स्टसेक 500/550 दोपहर 1.4 बजे
नोवासेक 6000 1250 पीएम

तालिका 9: सामान्य अनुक्रमण उपकरणों की सांद्रता लोड करने के लिए उदाहरण।

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Discussion

दवा की खोज और दवा के विकास से सेलुलर प्रक्रियाओं के समग्र दृष्टिकोण से बहुत लाभ हो सकता है जो थोक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स प्रदान कर सकते हैं। फिर भी, यह दृष्टिकोण अक्सर मानक थोक आरएनए-सीक्यू प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग की उच्च लागत से सीमित होता है, जो अकादमिक सेटिंग्स में इसके आवेदन के साथ-साथ औद्योगिक मापनीयता के लिए इसकी क्षमता को प्रतिबंधित करता है।

प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम सेल विगलन और पुस्तकालय की तैयारी के प्रारंभिक कदम हैं. विगलन के बाद कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता सुनिश्चित करना सफल उपचार और प्रतिलेख विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। सीडीएनए संश्लेषण तक सेल कटाई और पुस्तकालय की तैयारी के पहले चरण आरएनए की अखंडता को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस स्तर पर सेल लाइसेट को हर समय बर्फ पर रखना और जितनी जल्दी हो सके नमूनों को संसाधित करना महत्वपूर्ण है। यदि अत्यधिक आरएनए गिरावट देखी जाती है, तो प्रयोगशाला सतहों और उपकरणों को किसी भी आरएनएसई गतिविधि को बाधित करने के लिए विशिष्ट उत्पादों से साफ किया जाना चाहिए।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वर्तमान में 24 घंटे की एक अधिकतम के लिए स्वस्थ दाताओं से PBMC पर दवा उपचार के लिए अनुकूलित है. एक अलग सेल प्रकार के साथ या लंबे समय तक इनक्यूबेशन लिए प्रयोग करने के लिए, बोने और संवर्धन की स्थिति के लिए सेल नंबर तदनुसार अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है।

इस प्रोटोकॉल के साथ, हम मानक प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके पीबीएमसी पर दवा उपचार पर ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए एक वर्कफ़्लो प्रदान करते हैं और वाणिज्यिक किट की कोई आवश्यकता नहीं होती है। इस दृष्टिकोण के साथ और आरएनए शुद्धि के कदम से बचने के लिए, हम यौगिकों की एक उच्च संख्या के समानांतर विश्लेषण के लिए अनुमति देने लागत काफी कम कर दिया.

क्योंकि इस प्रोटोकॉल इन विट्रो परख में एक पर आधारित है, इसकी प्रमुख सीमा यह है कि यह दवाओं है कि विभिन्न bioactivity के लिए नेतृत्व कर सकता है के किसी भी चयापचय प्रसंस्करण का मूल्यांकन नहीं कर सकते. इसके अतिरिक्त, कैप्चर किए गए टेप और अनुक्रमण गहराई की संख्या मानक थोक पूर्ण-लंबाई ट्रांसक्रिप्टोमिक्स विधियों की तुलना में कम होगी, इन आंकड़ों के उपयोग को उन अनुप्रयोगों के लिए रोकती है जिनके लिए उच्च सूचना सामग्री की आवश्यकता होती है, जैसे कि एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं के अंतर स्प्लिसिंग या मात्रा का ठहराव।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

जेएलएस जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति (EXC2151-390873048) के साथ-साथ एससीएचयू 950/8-1 के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) द्वारा समर्थित है; जीआरके 2168, टीपी 11; CRC SFB 1454 मेटाफ्लेमेशन, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, BMBF द्वारा वित्त पोषित उत्कृष्टता परियोजना डाइट-बॉडी-ब्रेन (DietBB); और अनुदान संख्या 733100 के तहत यूरोपीय संघ परियोजना SYSCID। एमबी डीएफजी (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352) द्वारा समर्थित है। एलबी डीएफजी (इम्यूडाइट बीओ 6228/2-1 - प्रोजेक्ट नंबर 513977171) और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति (EXC2151-390873048) द्वारा समर्थित है। BioRender.com के साथ बनाई गई छवियां।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conical tube fisher scientific 10203001
Adhesive PCR Plate Seals Thermo Fisher Scientific AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
AMPure XP beads Beckman Coulter A 63881
Betaine  Sigma-Aldrich 61962
Cell culture grade 96-well plates Thermo Fisher Scientific 260860
Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) Integra Bioscience 158300
Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each Fermentas R0192
DMSO Sigma-Aldrich 276855
DTT (100 mM) Invitrogen 18064-014
EDTA Sigma-Aldrich 798681 for adherent cells
Ethanol Sigma-Aldrich 51976
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 26140079
Filter tips (10 µL) Gilson  F171203
Filter tips (100 µL) Gilson  F171403
Filter tips (20 µL) Gilson  F171303
Filter tips (200 µL) Gilson  F171503
Guanidine Hydrochloride Sigma-Aldrich G3272
ISPCR primer (10 µM) Biomers.net GmbH SP10006 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) KAPA Biosystems KK2601
Magnesium chloride (MgCl2)  Sigma-Aldrich M8266
Magnetic stand 96 Ambion AM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer  Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS
Nextera-compatible indexing primer Illumina
Nuclease-free water Invitrogen 10977049
PBS Thermo Fisher Scientific AM9624
PCR 96-well plates Thermo Fisher Scientific AB0600
PCR plate sealer Thermo Fisher Scientific HSF0031
Penicillin / Streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15070063
Qubit 4 fluorometer Invitrogen 15723679
Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) TAKARA 2313A
RPMI-1640 cell culture medium  Gibco 61870036 If not working with PBMCs, adjust to cell type 
SMART dT30VN primer Sigma-Aldrich 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standard lab equipment various various e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) Thermo Fisher Scientific 18064-014
SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) Thermo Fisher Scientific 18064-014
Tagment DNA Buffer (TD) Illumina FC-131-1096 Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples)
TapeStation system 4200 Agilent G2991BA
Thermocycler (S1000) Bio-Rad 1852148
TSO-LNA (100 uM) Eurogentec 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mixer Sigma-Aldrich Z258415

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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जीवविज्ञान अंक 204
लागत प्रभावी ट्रांसक्रिप्टोमिक-आधारित ड्रग स्क्रीनिंग
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Leidner, J., Theis, H., Kraut, M., Ragogna, A., Beyer, M., Schultze, J., Schulte-Schrepping, J., Carraro, C., Bonaguro, L. Cost-Efficient Transcriptomic-Based Drug Screening. J. Vis. Exp. (204), e65930, doi:10.3791/65930 (2024).

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