Beteendeåldrings- och livslängdsanalyser med hög genomströmning med hjälp av livslängdsmaskinen

Åldrande är en komplex, mångfacetterad process som kännetecknas av en nedgång i en organisms fysiologiska funktion, vilket leder till en ökning av risken för sjukdom och död över tid¹. Livslängd, mätt som tiden från födseln eller början av vuxenlivet till döden, ger ett entydigt utfall av åldrande² och en indirekt men strikt kvantitativ proxy för att mäta den relativa åldringshastigheten mellan populationer³. Åldrandestudier är ofta beroende av noggranna mätningar av livslängden, liknande kliniska prövningar, för att jämföra resultaten mellan en population som exponerats för en intervention och en oexponerad kontrollgrupp. Dessvärre genomsyrar reproducerbarhetsproblem åldrandeforskningen, ibland på grund av statistiskt underdrivna experiment⁴ och ofta på grund av livslängdsanalysernas inneboende känslighet för subtila variationer i miljön⁵. Robusta experiment kräver flera replikat av stora populationer, och denna process drar särskilt nytta av den experimentella skalbarhet som automatisering⁶ erbjuder.

De rigorösa kraven på livslängdsanalyser har sitt ursprung i oförutsägbarheten i själva åldringsprocessen. Isogena individer som lever i identiska miljöer uppvisar olika dödstider och fysiologisk nedgång⁷, vilket tyder på att livslängden innebär en hög grad av stokasticitet ^7,8. Därför krävs stora populationer för att mäta kvantitativa förändringar i åldrandeprocessen, såsom förändringar i medel- eller maxlivslängden, och för att övervinna fördomar som uppstår på grund av individuell variabilitet. Dessutom är en kapacitet för analyser av hög genomströmning avgörande för att stödja studier av överlevnadskurvans former och modeller av dynamiken i åldrande⁹.

Rundmasken Caenorhabditis elegans är en ovärderlig modell för åldrandeforskning på grund av dess korta livslängd, genetiska traktabilitet och snabba generationstid, vilket understryker dess lämplighet för åldrings- och livslängdsanalyser med hög genomströmning. Traditionellt har livslängden i C. Elegans har mätts genom att följa en synkroniserad, liten population på cirka 50-100 djur över tid på fasta medier och skriva ner tidpunkten för enskilda dödsfall. När djuren åldras och förlorar rörlighet måste djuren individuellt petas individuellt och kontrolleras om det rör sig om huvud eller svans för små rörelser i huvudet eller svansen. Detta är vanligtvis en tråkig och mödosam process, även om ansträngningar har gjorts för att påskynda den 10,11,12. Det är viktigt att påpeka att långsamma experimentella pipelines hindrar framsteg i vår förståelse av åldrande och effektiviteten av testade interventioner.

För att möta åldrandeforskningens krav på kvantitativa data har många tekniker utvecklats för att automatisera datainsamling, inklusive ett anmärkningsvärt utbud av tillvägagångssätt från mikrofluidikkammare till flatbäddsskannrar 13,14,15,16,17,18. LSM skiljer sig från andra metoder genom sin omfattande optimering för insamling av mycket exakta och exakta livslängdsdata, vilket uppnås genom utveckling av noggranna kalibreringsprotokoll för utrustning i kombination med en omfattande programvarusvit som gör det möjligt för användare att validera, korrigera och förfina automatiserade analyser¹³. Även om programvaran i princip kan tillämpas på olika avbildningsmodaliteter, använder de flesta användare i praktiken flatbäddsskannrar som modifierats för att möjliggöra finjusterad kontroll över omgivningens temperatur och luftfuktighet - faktorer av avgörande betydelse på grund av deras stora effekt på livslängden¹⁹. LSM tar bilder av nematoder var 20:e minut med intervaller som sträcker sig från dagar till månader, beroende på miljöförhållanden och genotyp. De data som produceras har mycket högre tidsupplösning jämfört med data från manuella analyser, och de insamlade bilderna ger en permanent visuell registrering av nematodernas position under hela livslängden. Med hjälp av maskininlärningsmetoder tilldelas dödstider automatiskt till varje individ. Dessa resultat kan valideras snabbt och manuellt med hjälp av ett klientprogram som kallas "Worm Browser". Som ett resultat av sin hårdvara och mjukvara kan LSM generera överlevnadskurvor som statistiskt sett inte går att skilja från manuell dödsbedömning i händerna på erfarna forskare, med den extra fördelen av minskad arbetsbelastning och högre skalbarhet¹³.

Den senaste versionen av LSM gör det också möjligt att studera beteendemässigt åldrande genom att samla in morfologiska och beteendemässiga data under hela nematodens liv och rapportera det tillsammans med varje individs livslängd. I synnerhet fångar LSM tiden för varje djurs kraftiga rörelseupphörande (VMC), ett landmärke som ofta används för att kvantifiera en individs "hälsospann" till skillnad från dess livslängd. Genom att samtidigt samla in data om livslängd och beteendemässigt åldrande stöder LSM studien av interventioner som kan ha olika effekter på olika fenotypiska resultat av åldrande²⁰. En mängd olika makroskopiskt observerbara fenotyper kan användas för att studera beteendemässigt åldrande, såsom kroppsrörelse eller svalgpumpning²¹, vävnadsintegritet²² och rörelsehastighet eller stimulusinducerad vändning¹⁷. Jämförelser mellan olika åldrandefenotyper kan stödja analyser av den kausala strukturen av åldringsprocesser. Till exempel användes jämförelsen mellan VMC och livslängd nyligen för att karakterisera två distinkta åldringsprocesser hos C. elegans²³.

LSM utvecklades ursprungligen för att mäta livslängden hos C. elegans, men stöder insamlingen av överlevnads- och beteendedata från en rad nematodarter, inklusive C. briggsae, C. tropicalis, C. japonica, C. brenneri och P. Pacificus²³. Tekniken underlättar studier av effekten av biologiska och miljömässiga interventioner på livslängd, stresstålighet och patogenresistens och kan kopplas till experimentella verktyg som riktade analyser av RNA-interferens eller auxininducerbara proteinnedbrytningssystem. Hittills har den använts i den vetenskapliga litteraturen för ett brett spektrum av applikationer 6,24,25,26,27,28,29,30.

Här beskriver vi ett steg-för-steg-protokoll för att utföra ett Lifespan Machine-experiment med agarplattor, från de inledande stadierna av experimentuppställningen till utdata av de resulterande överlevnadskurvorna. En utmärkande egenskap hos LSM är att arbetet är mycket frontladdat, vilket innebär att majoriteten av forskarens tid spenderas under experimentell uppställning och, i liten utsträckning, under efterbildsinsamling. Datainsamlingen är helt automatiserad under hela experimentet och gör det möjligt för forskaren att få en "handsfree"-upplevelse. De steg som beskrivs här är gemensamma för många olika typer av överlevnadsanalyser - samma experimentella uppställning utförs för livslängds-, termotolerans-, oxidativ stress- och patogenesanalyser. I avsnittet med representativa resultat diskuterar vi en delmängd av data från ett nyligen publicerat manuskript för att illustrera effektiviteten i analyspipelinen och lyfta fram de viktigaste stegen under bildanalys²³.

1. Krav på programvara och hårdvara

1. Flatbäddsskannrar: I princip kan LSM implementeras med hjälp av en mängd olika bildbehandlingsenheter. Detaljerade instruktioner för skannermodifieringar och fokusering finns på andra ställen¹³. LSM-hårdvaran visas i kompletterande figur 1.
2. Verktyg för dataanalys: LSM-programvaran har tre samverkande komponenter: ett Linux-baserat programvarupaket för skannerkontroll, ett webbläsarbaserat metadatahanteringspaket och ett Windows- och Linux-programpaket för klientbildanalys. Se anvisningarna för att installera programvaruverktyg som publicerats på GitHub-lagringsplatsen (https://github.com/nstroustrup/lifespan).
3. Programvara för datavisualisering och validering: Använd Worm Browser, ett klientprogram, för att schemalägga experimenten, validera bildanalysen, utföra manuella anteckningar av nematodernas rörelse och mata ut överlevnadsdata. Binära körbara filer finns för Worm Browser i Windows 7, Windows 8 och Windows 10, och Worm Browser kompileras från källkod i Linux eller Apple iOS. En installationsguide finns tillgänglig på GitHub-lagringsplatsen som nämns ovan.

Kompletterande figur 1: Livslängd Maskinhårdvara. En flatbäddsskannerenhet med öppet lock för att visa de laddade plattorna, som är placerade med framsidan nedåt i 16 öppningar skurna på en gummimatta. Gummimattan placeras på ytan av en glasskanner. Etiketter för förhållandena är skrivna på sidorna av plattorna för att undvika problem under bildanalys. Märkning av tejp med numret ("1") och/eller namnet på enheten ("Jabba") underlättar senare verifiering av provplatsen när du arbetar med flera skannerenheter. Mer information om LSM-hårdvarukomponenterna finns på andra ställen¹³. Klicka här för att ladda ner den här filen.

2. Installation före dagen för experimentet

1. Temperaturkalibrering av inkubatorn: Miljötemperaturen är en viktig bestämningsfaktor för C. elegans livslängd¹⁹. För att få exakta resultat ska du ta bilder vid en noggrant kalibrerad temperatur som hålls konstant under hela experimentet. För att åstadkomma detta, några dagar innan experimentet börjar, mät och kalibrera temperaturen på varje skanners yta under drift. Använd termoelement med hög precision enligt beskrivningen på andra ställen³¹ (se materialtabellen).
2. Skannerplattans layout: Innan experimentet påbörjas ska du planera den optimala layouten av odlingsplattorna för varje skanner.
   OBS: Syftet med detta är att undvika införandet av förväxlingsfaktorer till följd av temperaturvariationer mellan skannrarna och över varje skanners yta. Skannrar skiljer sig subtilt åt i sin genomsnittliga yttemperatur och uppvisar dessutom subtila temperaturförskjutningar över ytan³¹.
   1. Skannerplattans position: För att kontrollera för dessa termiska effekter i den efterföljande dataanalysen, randomisera eventuella biologiska kovariater angående skannerpositionen och standardisera plattans placering över alla skannrar.
   2. Antal prover över skannrarna: När du använder 16 gummimattor (se materialtabellen), placera fyra plattor per tillstånd i varje skanner, med totalt minst fyra skannrar. Detta säkerställer att varje tillstånd fördelas över flera skannrar, så att de störande effekterna av skannertemperaturen kan identifieras och avlägsnas under dataanalys¹³. För att göra den här analysen enklare kan du inkludera ett delat referensvillkor (t.ex. vildtypsprover) på varje skanner.
      OBS: I allmänhet, på grund av placeringen av skannerfläktarna, är plattorna i det övre högra hörnet av gummimattan mer benägna att torka ut. Lämna den här platsen tom om det behövs.
3. Plattor och provberedning
   1. Hällning av odlingsplattorna: För optimal torkning av skannerodlingsplattorna (se materialtabellen), häll agarmedium 4 dagar innan nematoderna laddas. Även om skannerns fokus är justerbart för att tillåta att olika volymer agar läggs till plattorna, är standardplattvolymen 8 ml.
      OBS: Det kan vara bra att hälla plattorna med en peristaltisk pump, särskilt för stora experiment.
   2. Sådd av plattorna: Sådd av plattorna med den önskade bakteriekulturen minst 2 dagar före experimentets början för att möjliggöra korrekt torkning och tillväxt av bakteriegräsmattan. Vanligtvis räcker det med 200 μL bakteriekultur för att bilda en gräsmatta som matar 40 nematoder i flera veckor.
      OBS: Plattorna som vanligtvis används för avbildning är tätare förseglade än vanliga petriskålar; Därför rekommenderas det att så och torka plattorna inuti en laboratoriehuv, vanligtvis i cirka 1 timme eller tills de är ordentligt torkade.
4. Hantering av nematoder
   1. Populationsstorlek: Antalet nematoder som på ett tillförlitligt sätt kan avbildas på en enda tallrik beror på genotypen, åldern vid vilken nematoderna läggs på plattor och mängden mat som läggs till varje tallrik. För livslängdsförsök som startar i tidig vuxen ålder, ladda cirka 40 djur per tallrik. Detta antal säkerställer tillräckligt med mat och undviker trängsel.
   2. Växande stora populationer: För att förbereda för populationsexpansion och synkronisering, börja med en population av nematoder som är lämplig för den valda synkroniseringsmetoden (se nedan). Sträva efter att utföra synkronisering på djuren vid deras ålder för maximal äggproduktion, vilket för vildtypsdjur av N2 är dag 2 i vuxen ålder³².
      OBS: En annan anledning till att synkronisera populationer genom att använda djur på deras andra dag i vuxen ålder är att ta bort moderns ålder som en bidragande faktor till populationsheterogenitet. Moderns ålder i C. Elegans har visat sig påverka flera fitnessegenskaper hos avkomman, där dag 2 vildtypsdjur producerar den "högsta kvaliteten" avkomma³³.
   3. Utföra ålderssynkronisering: För att få korrekta resultat, synkronisera djurens ålder så exakt som möjligt. I detta protokoll utförs ålderssynkronisering med hjälp av en modifierad hypokloritbehandling³⁴. Andra metoder kan vara synkronisering genom äggläggning, genom att L1-larver stoppas eller genom att manuellt plocka L4-larver.
      OBS: För ålderssynkronisering genom hypokloritbehandling, förvänta dig att få tre till fyra ägg från varje vuxen hermafrodit.
   4. Upprätthållande av avkommefria populationer: Upprätthåll avkommefria populationer genom att exponera nematoder under deras sena L4-stadium för 5-fluoro-2'-deoxiuridin (FUdR)³⁵.
      OBS: Vid låga doser är FuDR dödligt för embryon under utveckling utan att producera makroskopiskt synliga förändringar i könscellerna eller ändra oocytproduktionens hastighet. Andra metoder inkluderar att använda temperatursterila mutanter, använda steriliserande RNAi-konstruktioner eller helt enkelt vänta tills postreproduktiv åldrande för att överföra nematoderna till plattor för avbildning.
   5. Överföring av populationer: Vid överföring av tusentals djur mellan plattor blir standardprotokollet med en platina/iridiumtråd mödosamt. Metoder som innebär flytande suspension av nematoder underlättar överföringarna och gör dem mer effektiva. Samla in nematoderna med M9 + Mg-buffert (Na₂HPO₄ 42,27 mM, KH₂PO₄ 22,05 mM, NaCl 85,56 mM, MgSO₄ 1 mM), minska den totala volymen när nematoderna sätter sig genom gravitationen och överför sedan snabbt nematoderna till plattorna som används för avbildning.
      ANMÄRKNING: Överföring av nematoderna i flytande suspension kan leda till variationer i antalet djur som överförs till varje platta. Försök att vara konsekvent med antalet nematoder på varje platta för att undvika experimentell variabilitet.
   6. Tillämpa interventioner: Att stoppa och starta om bildtagning under ett experiment komplicerar bildanalysen (se diskussion). Starta därför LSM-experimenten först efter att all nödvändig nematodhantering har slutförts.
5. Sterilisering av gummimattorna: Autoklavera ett stort antal mattor samtidigt genom att slå in dem individuellt i aluminiumfolie.
   OBS: Gummimattorna bör steriliseras mellan användningarna för att undvika ansamling av svamp- eller bakterieföroreningar. De flesta typer av gummi som vanligtvis används bryts ned av aggressiv etanolbehandling.

3. Inställning på dagen för experimentet

1. Tallriksstöd och förberedelse av skannerglas: För att förenkla hanteringen av tallriken, lägg inte petriskålarna direkt på skannerytan, utan håll dem istället på plats med gummimattor som stöds av glasrutor (se materialtabellen). Populationer avbildas genom detta glas, så håll glaset rent och behandlat med anti-dimma, hydrofob och steriliserande beläggning (se materialtabellen).
   1. Innan du laddar plattorna i inkubatorn, rengör ytan på plattans stödglas på båda sidor med anti-dimma glasrengöringsmedel.
   2. Innan du laddar plattorna på deras stödglas, applicera en skyddande hydrofob glasbehandling (se materialtabellen) för att minimera imma på den sida av glaset som kommer i kontakt med gummimattan. Sprid ut denna behandling väl och låt den stå på glaset i 5-10 minuter innan du går vidare till nästa steg. Rengör kraftigt efter applicering för att ta bort eventuella rester.
   3. Applicera 70 % etanol för att desinficera ytan på glaset som kommer i kontakt med gummimattan. Låt stå i 1 min eller 2 min och ta sedan bort med en trasa eller pappershandduk.
2. Ladda plåtarna på skannrarna
   1. Placera först de autoklaverade gummimattorna ovanpå det behandlade plattans stödglas.
   2. Ta bort locket från plattorna som används för avbildning med laddade nematoder och placera dem på gummimattor som vetter mot glasytan. Se till att gummimattan är tätt förseglad runt alla tallrikar, t.ex.ample, genom att lägga till ytterligare en glasskiva ovanpå och se till att den ligger platt eller genom att knacka på toppen av varje tallrik (lösa plattor kommer att röra sig något och träffa glaset, vilket gör ett ljud, medan tätt fastsatta plattor inte rör sig när de knackas).
      OBS: Det är användbart att individuellt märka varje ark av plåtstödglas med markeringstejp med information om plattans innehåll och den avsedda skannern. Dessa data kan användas efter experimentet för att lösa eventuella oklarheter om plattornas placering.
   3. Innan du laddar plattorna i skannrarna, koppla ur skannerfläktarna för att skydda experimentledarens fingrar under plattladdning.
   4. Skjut försiktigt plattorna och glasskivan som stöder dem på skannerns yta.
      OBS: Undvik att trycka direkt på gummimattan, eftersom detta gör att mattan glider över plattans stödglas. När mattorna glider slås plattorna ofta loss från mattan.
   5. Återaktivera skannerfläktarna och bekräfta visuellt att de främre och sidofläktarna är strömförsörjda. Om skannrarna är avstängda slår du på dem nu.

4. Förvärv före bilden

OBS: Ett omfattande flödesschema som sammanfattar alla programvarubaserade steg under bildhämtning visas i figur 1.

Bild 1: Grafisk översikt över pipelinen för Lifespan Machine-bildanalys. Stegen före, under och efter bildinhämtning utförs till stor del i webbgränssnittet (WI, i rött) och i maskbläddraren (WB, i grönt). Vissa steg utförs på andra plattformar (O, i blått), till exempel TXT-dokument i steg 3a, Photoshop eller motsvarande i steg 4b och JMP eller motsvarande i steg 13. Klicka här för att se en större version av denna figur.

1. Inställning av bildinsamling: Generera en fil som anger experimentschemat och placeringen av plattor på varje skanner för att konfigurera bildinsamlingen.
   Den här filen innehåller viktiga metadata, t.ex. experimentets titel, frekvensen för bildtagningar och experimentets totala varaktighet. Vanligtvis genereras inte den här filen de novo för varje experiment, men i stället återanvänds experimentfiler från tidigare experiment som mallar. För en användares första experiment tillhandahålls en mallfil (Kompletterande fil 1).
   1. Begär förhandsgranskningar: Ange platsen för alla plåtar på varje skanner. Flera verktyg tillhandahålls för att påskynda denna process. Använd först skannern för att få en bild av hela skannerytan, kallad "Förhandsgranska fångst". Se till att förhandsgranskningsbilderna tydligt visar hela ytan på varje plåt som ska avbildas (Figur 2A) utan ränder eller beskärning av plåtkanter.
      1. Använd web gränssnitt, hitta Bildförvärv avsnitt på huvudsidan och följ länken som heter Capture Devices and Image Servers. På den sidan klickar du på knappen märkt Sök efter nya enheter (dvs. skannrar) i rutan Image Capture and Processing Servers (Bildinsamlings- och bearbetningsservrar ). Övervaka serverns framsteg när det gäller att upptäcka skannrar genom att klicka på länken [log] bredvid servern.
         OBS: Se till att önskade skannrar är påslagna och anslutna till servern innan du utför detta steg.
      2. På samma sida i webbgränssnittet kontrollerar du att varje skanner som är ansluten till servern visas i rutan Bildinsamlingsenheter . Etiketten "Saknas" under "Aktuell status" visas inte längre om enheten har upptäckts. Markera kryssrutan för varje skanner som innehåller nyladdade plåtar.
      3. Längst ned i avsnittet Bildinsamlingsenheter klickar du på knappen Begär förhandsgranskning . Inom 1 minut eller 2 minuter ska skannrarna tändas och börja skanna.
         OBS: Den initiala positionen för glasstödskivorna måste ofta justeras för att få alla plattor inom viewable område. Positioner kan korrigeras genom att inspektera förhandsgranskningsbilder och göra justeringar av plattans position och ta om nya förhandsgranskningsbilder. Om skanningen går extremt långsamt (flera minuter för en skanning) eller om förhandsgranskningsbilder innehåller långa vita ränder, är det ett tecken på att en platta, gummimattan eller något annat föremål blockerar ljuset inom skannerns kalibreringsområde (indikeras av vita pilar på skannerns yta). Alla föremål bör flyttas så att endast glasstödsglaset upptar detta område.
   2. Definiera skanningsområdena: Följ nästa steg i maskbläddraren för att analysera förhandsvisningsbilderna och sätt ihop dem till en enda sammansatt bild, som används för att ange platsen för varje plåt för dataanalysen. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som figur 2B.
      1. Börja med att använda maskbläddraren och öppna varje förhandsgranskningsbild genom att välja menyalternativet Arkiv > Öppna bild och välj önskad bild.
      2. På varje bild klickar du för att markera kolumnerna för regioner med plattor (om gummimattan har 16 plattor, välj 4 kolumner).
         OBS: Skanningsområdena bör anges som höga kolumner (inte breda rader) eftersom skannerfångsten är långsammare för bredare områden, vilket resulterar i suddiga bilder på grund av nematodrörelser.
      3. När alla bilder har definierats exporterar du områdesspecifikationerna till disken genom att välja menyalternativet Bildhämtning > Definiera skanningsområden > Spara valda skanningsområden på disken och välja önskad plats.
   3. Generera experimentschemat:
      1. Sammanställ en fil som innehåller experimentets namn, de fysiska platserna för varje kolumn på skannrarna (kopierad från filen med skanningsområden som genererades i steg 4.1.2.3), experimentets totala varaktighet och bildtagningsfrekvensen, och spara den både som en TXT- och som en XML-fil.
      2. Klicka sedan på Bildhämtning > Skicka experimentschema i Worm Browser och välj den genererade XML-filen. Maskbläddraren frågar om en sammanfattning av schemat ska visas eller om experimentet ska köras. Klicka på Generera en sammanfattningsfil.
   4. Validera sammanfattningsfilen: När experimentschemat har skickats kommer maskbläddraren att skriva ut en sammanfattning av schemat. Den här sammanfattningen visas på skärmen och skrivs till disken. Läs den och kontrollera datumen för schemalagda avbildningar, samt plats, namn och antal skannrar.
   5. Skicka in experimentschemat: När du är nöjd med sammanfattningsfilen läser du in XML-filen för experimentschemat igen i maskbläddraren genom att välja menyalternativen Bildhämtning > Skicka experimentschema. Maskbläddraren frågar en andra gång om en sammanfattning av schemat ska visas eller om experimentet ska köras. Den här gången klickar du på Kör! .
      OBS: Några minuter efter att du har skickat in experimentet är det klokt att använda webbgränssnittet för att bekräfta att experimentet har skickats in och att skanningar samlas in av alla skannrar. Det är vanligt att de första skanningarna missas, särskilt i stora experiment.
   6. Organisera experiment i webbgränssnittet: Ett upptaget skannerkluster kan producera hundratals experimentella datauppsättningar som samlats in av många olika användare. Om du vill organisera den här listan tilldelar du experiment till separata grupper, till exempel motsvarande namnet på den användare som ansvarar för experimentet.
      1. Skapa en ny grupp eller ändra en befintlig: Skapa nya grupper i webbgränssnittet genom att klicka på Hantera experimentgrupper under rutan Bildhämtning. På den nya sidan som visas lägger du till önskat namn på Skapa ny grupp och klickar på Skapa. Om du vill ändra namnet på en befintlig grupp väljer du önskad grupp bredvid Ändra befintlig grupp i samma ruta och väljer sedan Ändra.
      2. Tilldela experiment till en grupp: Om du vill tilldela nya experiment till en viss grupp går du till webbgränssnittet och letar reda på önskat experiment, som som standard tilldelas gruppen Ingen grupp längst ned i experimentlistan. Klicka på länken till höger i experimentavsnittet där det står Redigera och använd listrutan för att välja namnet på den grupp som ska användas. Välj sedan Spara.
   7. Avbryt ett experiment:
      LSM kommer att fortsätta att fungera autonomt tills de slutliga skanningarna anges i experimentschemat. När ett experimentellt schema har slutförts kommer LSM som standard att fortsätta samla in skanningar men omedelbart kassera bilddata i en process som kallas autoscanning. Dessa automatiska genomsökningar utförs för att förhindra att skannrarna stängs av och svalnar, och för att upprätthålla en standardtemperaturprofil så att andra experiment som körs i samma utrymme (men från ett annat experiment) inte påverkas av att andra skannrar stängs av.
      1. Stoppa automatiska genomsökningar: Om du vill stoppa de automatiska genomsökningarna från ett pågående experiment i webbgränssnittet klickar du på Redigera bredvid önskat experiment, sedan Avbryt väntande genomsökningar och väljer Avbryt schemalagda avbildningar.

Bild 2: Förhandsgranska tagning av bild och val av skanningsområde. (A) För varje skanner i experimentet genereras en förhandsgranskningsbild. (B) Val av en rad plåtar i taget (röda rutor), vilket ökar skanningshastigheten och förhindrar maskrörelseoskärpa till följd av skanningsområden som är för breda. Klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Bildtagning

Följande steg kan utföras både medan experimentet körs och efter att det har avslutats.

1. Mata ut experimentets maskfil: Råbildsdata från skannrar innehåller många områden som inte behöver bearbetas (områden utanför plåtar). För att fokusera analysen på varje platta individuellt skapas en "mask" som anger det område som upptas av varje platta på varje skanner. Generera den här masken genom att rita varje plattas position som ett överlägg på bilder som samlats in av skannrarna.
   1. Använd maskbläddraren och välj önskat experiment genom att välja Arkiv > Välj aktuellt experiment och klicka sedan på experimentets namn.
   2. I maskbläddraren väljer du Bildhämtning > Definiera exempelmasker > Generera sammansatt experimentmask och sparar masken på önskad plats. Se till att den resulterande filen ser ut ungefär som i figur 3A.

Figur 3: Specifikation av plåtplaceringarna för varje skanner med hjälp av exempelmasker. För att säkerställa en oberoende analys av plattorna inom de kolumnval som visas i figur 1 måste enskilda plattor identifieras genom att generera en bildmasksammansättning. (A) En inspelning av skanningarna av skannrarna öppnas med ett bildmanipuleringsprogram (notera namnet på skannern "han" ovanför ett skannat urval och "a-d" som hänvisar till var och en av kolumnerna). (B) De enskilda stegen i maskgenereringen för att markera platsen för varje plåt i maskkompositen kräver att bakgrunden ställs in på svart, (C) borttagning av ojämna kanter och kanter på icke-markerade plåtar genom att expandera och sedan krympa bakgrunden, och (D) välja förgrundsplattorna och fylla områdena helt med vita pixlar. (E) För att LSM ska kunna känna igen enskilda plåtar i de skannade raderna fylls varje vitt område i en rad med en annan nyans av grått, vanligtvis i ökande ljusstyrka. (F) I detta skede sparas masken (LZW-komprimering utan lager specificerade om den genereras i Photoshop). Masken genomsöks sedan av maskbläddraren och en visualisering av masken genereras av programvaran. En korrekt maskvisualisering bör visa en definierad fyrkant per platta med ett litet kryss i mitten och en annan färg för varje rad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Kommentera experimentets mask: Öppna filen som genererades i föregående steg med ett bildmanipuleringsprogram (t.ex. Photoshop eller GIMP) för att markera platsen för varje platta i bilden. En översikt över alla maskredigeringssteg i Photoshop beskrivs nedan.
   1. I Photoshop väljer du fyllningsverktyget med toleransen inställd på noll, det intilliggande alternativet markerat och kantutjämningen omarkerad. Klicka på den grå bakgrunden för att ställa in den helt svart. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som figur 3B.
   2. Använd trollstavsverktyget för att välja den svarta bakgrunden, med aliasen inställd på av, toleransen inställd på noll och det sammanhängande alternativet valt. För att jämna ut kanterna, expandera den valda bakgrunden med 30 pixlar genom att klicka på Välj > Ändra > Expandera. Krymp sedan markeringen med 20 pixlar på Välj > ändra > kontrakt. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som figur 3C.
   3. Om du vill fylla den utjämnade bakgrunden helt med svarta pixlar, t.ex. genom att ställa in fyllningsverktygets tolerans på 255 och fylla det markerade området. Klicka sedan på Välj > Invertera för att invertera markeringen och välj förgrunden. Om du vill fylla det nya området helt med vita pixlar, t.ex. genom att ställa in fyllningsverktygets tolerans på 255 och fylla området med vitt. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som i figur 3D.
   4. Om du vill separera varje platta i ett enda område fyller du varje rad med olika gråtoner i ökande intensitet. Detta kan göras med fyllningsverktyget och sedan genom att välja önskad färg, med toleransen inställd på 0. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som i figur 3E. Spara den i en LZW-komprimering utan "Lager" angivna.
      OBS: Ordningen på plattorna bestäms av färgen på de angivna regionerna. Om du vill namnge plåtarna 1–4 uppifrån och ned anger du färgerna i ökande intensitet för varje rad.
   5. I maskbläddraren väljer du Bildhämtning > Definiera exempelmasker > Analysera plåtplatser som ritats på Experiment Mask Composite och väljer den fil som genererades i föregående steg. Programvaran kommer nu att ta en stund att analysera den inskickade masken.
   6. Maskbläddraren visar en maskvisualisering. Granska masken för potentiella fel i filen. Se till att varje rad med plattor är fylld med en annan färg och kontureras av en färgad rektangel. Se till att den resulterande bilden ser ut ungefär som i figur 3F.
      Om två eller fler cirklar visas på en enda platta, eller om två cirklar har samma färg, går du tillbaka till steg 5.2 för att korrigera maskfilen och läser in den igen i maskbläddraren.
   7. När du har kontrollerat att maskvisualiseringen är korrekt väljer du Bildhämtning > Definiera exempelmasker > Skicka sammansatt analyserad experimentmask till klustret i maskbläddraren. Bildanalysservern kommer nu att analysera platsen för alla plattor i experimentet.
3. Applicera masken: LSM använder masker för att dela upp råbildsdata i enskilda plåtar. Starta den här processen genom att schemalägga ett maskprogramjobb med hjälp av webbgränssnittet.
   1. Innan du skickar jobbet kontrollerar du att alla skannrar har identifierat områden i masken. Gå till huvudsidan i webbgränssnittet, leta upp namnet på experimentet och kolumnen Bildanalys och klicka på Kör analys. Kontrollera att alla enheter under Experimentexempel har regioner identifierade.
   2. För att applicera masken, på samma gränssnitt, klicka på Nytt jobb för alla prover. I rutan Schemalägg ett jobb för enskilda bilder markerar du rutan Använd mask och sedan Spara jobb.
      OBS: Masken kommer att tillämpas på alla bilder som redan tagits, såväl som på alla bilder som tagits i framtiden.
4. Utför plåtkvalitetskontroll:
   OBS: Plattor som lider av kontaminering, uttorkning eller imma censureras i detta skede av bildanalysen. Ett exempel på förorenade, uttorkade, immiga och optimala plattor visas i figur 4. Andra orsaker till censur är svält, tomma tallrikar eller larver i sterila populationer. Ogiltiga plattor innehåller ofta komplexa former som maskinen försöker tolka som nematoder. Det är viktigt att utesluta ogiltiga plåtar i detta steg för att förhindra långa bearbetningstider i senare steg av bildanalysen.
   1. Använd webbgränssnittet för att utesluta de plåtar som ska censureras genom att hitta önskat experiment och kolumnen Annotate Plate Information och välja By Image.
   2. För att inspektera plattorna, klicka på Visa bilder.
      OBS: Om steget för att visa bilder inte fungerar korrekt kan det bero på att Linux-servern inte är korrekt konfigurerad. Instruktioner om hur du gör detta finns i installationsguiden för programvara i det tidigare nämnda GitHub-arkivet.
   3. Om du vill utesluta plåtar markerar du rutan Censurera, väljer ett alternativ i listrutan som heter Orsak censurerad och klickar sedan på Spara för varje sida.
5. Lägg till metadatainformation: Metadata beskriver innehållet i varje platta i ett experiment. Denna information ingår sedan i alla statistiska datafiler som därefter genereras.
   1. För att lägga till metadatainformation i förhållande till stammen, genotypen, temperaturen, maten, etc., gå till huvudsidan i web gränssnitt, hitta önskat experiment och kolumnen som heter Annotate Plate Information och välj Efter position.
   2. Ange etiketterna och välj de skannrar som du vill spara metadata för genom att klicka på Spara på enheter i det nedre vänstra hörnet.
   3. Om du vill återanvända metadata mellan olika skannrar utan att behöva ange alla etiketter igen går du till Läs in från enhet i det övre högra hörnet, väljer den skanner som du vill återanvända metadata från och klickar på Läs in från enhet.
6. Ange "nollålderstid": Som standard mäter LSM tiden i förhållande till början av UNIX-epoken. Detta är sällan lämpligt, så det krävs en specifikation av en referenstid (t.ex. det datum då alla individer kläcktes eller nådde vuxen ålder).
   1. Om du vill ange information om nollålderstid går du till webbgränssnittets huvudsida, letar reda på önskat experiment och kolumnen Bildanalys och väljer Kör analys.
   2. På den nya sidan som visas väljer du Nytt jobb för alla regioner. I rutan som heter Uppdatera regioninformation väljer du Tid då djuren hade 0 ålder, lägger till informationen och klickar sedan på Uppdatera valda fält.
      OBS: Om alla djur inte delar samma nollålderstid, välj istället Nytt jobb för specifika djurtyper och upprepa stegen ovan för varje grupp.
7. Schemalägg maskdetekteringen: LSM kan automatisera detekteringen av varje nematod baserat på dess position på plattan.
   1. Om du vill starta den automatiska identifieringen av nematoder för varje bild går du till webbgränssnittets huvudsida, letar reda på önskat experiment och kolumnen Bildanalys och väljer Kör analys.
   2. På den nya sidan som visas klickar du på Nytt jobb för alla regioner och sedan på rutan Schemalägg ett jobb för enskilda bilder och markerar rutorna Medianfilter > Tröskelvärde > maskidentifiering > Spara jobb. Dessa jobb kommer att tillämpas på alla tidigare och framtida bilder som tagits.
      OBS: För att schemalägga ett jobb endast för en specifik stam eller ett specifikt tillstånd, klicka istället på Jobb för specifika djurtyper. Objektklassificering utförs med hjälp av SVM-modeller som anges som filer som lagras i undermappen Modeller i LSM:s katalog för långsiktig lagring. V2.0-parameteruppsättningar för nematoddetektering för LSM kan laddas ned från GitHub-lagringsplatsen.

Figur 4: Plåtkvalitetskontroll med hjälp av web gränssnitt. Censurering av suboptimala plattor i webbgränssnittet före maskrörelseanalysen är avgörande för att snabba upp bildbehandlingspipelinen. Exempel på plattor som ska avlägsnas är (A) uttorkning, (B) kontaminering eller (C) imma, beroende på vad som är fallet. D) Optimala plattor som ska ingå i den fortsatta analysen. En skalstapel på 10 mm läggs ovanpå en förhandsgranskningsbild. Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Hämtning efter bild

OBS: När maskdetekteringen är klar måste alla data som samlas in från experimentet aggregeras över tid för att spåra varje individ under deras livslängd och identifiera alla individers dödstider. Vänta tills alla djur i försöket har dött och tills alla maskdetekteringsjobb har slutförts och utför sedan följande steg:

1. Schemalägg rörelseanalysen:
   1. Rörelseanalysen integrerar alla experimentella data över tid för att uppskatta dödstiderna. Starta det här jobbet genom att gå till webbgränssnittets huvudsida och leta reda på önskat experiment i kolumnen Bildanalys. Välj länken Kör analys.
   2. På den nya sidan som visas klickar du på länken Nytt jobb för alla regioner, och i rullgardinsmenyn Schemalägg ett jobb för en hel region väljer du Analysera maskförflyttning och klickar på knappen Spara jobb.
   3. LSM-bildinsamlingsservern kommer automatiskt att börja analysera rörelser över alla plattor.
      OBS: Rörelseanalys är det enskilt största jobbet. På en modern flerkärnig processor kan analysen av varje platta från ett 1 månadslångt livslängdsexperiment ta 20 minuter eller mer.
2. Generera en storyboard: När rörelseanalysen är klar tillåter LSM-storyboarden användare att manuellt validera de automatiserade resultaten och se till att programvaran gör korrekta antaganden om nematodens morfologi och beteende.
   1. På huvudsidan i webbgränssnittet letar du upp önskat experiment och kolumnen Bildanalys och väljer Kör analys. På den nya sidan som visas klickar du på Nytt experimentjobb. I avsnittet Schemalägg ett jobb för en hel region väljer du sedan Generera djurstoryboard och klickar på Spara jobb.
   2. När LSM har genererat storyboarden går du till maskbläddraren och väljer önskat experiment. När du är tillbaka på huvudmenyn väljer du Validation > Browse Whole Experiment > Immediately after Each Worm's Death.
3. Kommentera storyboards i Worm Browser: En typisk storyboard i Worm Browser ska se ut så här Figur 5.
   1. Kommentera "icke-mask"-objekt
      OBS: Varje objekt som upptäcks under rörelse visas på storyboarden, sorterat efter den beräknade dödstiden. Om inte användaren anger något annat kommer varje objekt att inkluderas i de resulterande överlevnadskurvorna. LSM-objektklassificeringen är avsiktligt kalibrerad för att ha en hög falskt positiv frekvens, som en kompromiss för att minimera antalet oupptäckta nematoder. Uteslutning av icke-maskobjekt är viktigt för att få överlevnadskurvor av hög kvalitet (se de representativa resultaten). Ett stort antal icke-maskobjekt finns vanligtvis på den första och sista sidan i storyboarden, som snabbt kan uteslutas manuellt i bulk.
      1. Om du vill utesluta objekt som inte är maskar på storyboarden högerklickar du en gång på objektets bild. Det uteslutna objektet kommer nu att kontureras av en vit ruta. Om du vill utesluta många objekt samtidigt håller du ned kontrolltangenten och högerklickar en gång på ett objekt, så utesluts alla objekt på storyboardsidan.
      2. När du har uteslutit ett objekt från analysen kan objektet inkluderas igen genom att högerklicka två gånger igen.
      3. För att spara anteckningarna som gjorts under storyboardanteckningen, klicka på knappen Spara . Vi rekommenderar att du ofta sparar förloppet när du kommenterar.
   2. Kommentera dödstiderna:
      OBS: Utan användaringripande uppskattar LSM exakt dödstiderna för de flesta populationer. Det rekommenderas dock att rutinmässigt bekräfta noggrannheten i de automatiserade resultaten genom att manuellt validera en slumpmässig delmängd av individer från varje experiment. Extra uppmärksamhet bör ägnas åt de mest kortlivade och mest långlivade individerna, eftersom eventuella fel i automatiserad analys tenderar att samlas i dessa grupper.
      1. Vänsterklicka en gång på ett objekt i storyboarden för att öppna ett nytt fönster som visar detaljerad tidsserieinformation om objektet. Det här fönstret gör det möjligt att inspektera alla bilder som samlats in av objektet under hela experimentet, samt kvantifiering av objektets rörelsedynamik och morfologi. Använd samma gränssnitt för att manuellt kommentera dödstiderna. Gränssnittet för anteckning om dödstid visas i figur 6.
      2. För att manuellt kommentera dödstiderna, vänsterklicka på den nedre raden vid den punkt som motsvarar dödstiden. Använd mellanslagstangenten och höger- eller vänsterpilarna på tangentbordet för att flytta genom tidsramarna, eller klicka direkt på fältet vid önskad tidsram.
         OBS: Visualiseringen representerar djurens rörelsetillstånd över tid, som ett horisontellt stapeldiagram med x-axelns markeringstid. Det rosa/lila avsnittet indikerar den tidsperiod under vilken föremålet rör sig kraftigt, gult indikerar svag rörelse, rött indikerar icke-rörliga djur och grönt indikerar perioden för dödsassocierad expansion. Nematoder uppvisar karakteristiska dödsrelaterade morfologiska händelser: en gradvis kroppssammandragning som vanligtvis inträffar före döden, följt av en snabb kroppsexpansion under eller omedelbart efter döden (figur 6B). Icke-maskobjekt som damm eller skuggor visar inte denna dynamik i kroppsstorlek och följer istället vanligtvis en linjär, gradvis förändring i storlek och intensitet över tiden. Dessa olika kroppsstorleksdynamiker ger en snabb och enkel metod för snabb klassificering och manuell uteslutning.
      3. Beroende på analysmetoden kan dödstiden betraktas som antingen tidpunkten för rörelsens upphörande (början av den röda stapeln i rörelsevisualiseringen) eller som tidpunkten för dödsrelaterad expansion (den gröna stapeln i rörelsevisualiseringen). För att manuellt kommentera kontraktions- och expansionshändelser, högerklicka på den nedre raden vid önskad tidsram.
   3. Vissa rudimentära visualiseringar av dödlighetsdata finns i Worm Browser-klienten. Överlevnadskurvor och diagnostik av dödstid visas för varje population som finns i storyboarden (figur 7). Se överlevnadskurvorna på vänster sida och spridningsdiagrammet som jämför tiden för kraftig rörelseupphörande (VMC) med tidpunkten för döden för varje individ på höger sida av storyboarden.
      OBS: Det är möjligt att gruppera dessa resultat enligt olika experimentella parametrar genom delinställning på den nedre stapeln för förhållanden som specifika stammar, skannrar eller plattor. Enskilda maskar kan väljas baserat på deras dödstider genom att vänsterklicka på enskilda punkter i VMC kontra dödstid-diagrammet.
4. Skriva dödlighetsdata till disk: LSM producerar dödlighetsdata i form av CSV-filer. Plotta de utmatade överlevnadskurvorna och analysera dem med valfri statistisk programvara som R, SAS, STATA eller JMP.
   1. Om du vill generera dessa filer väljer du experimentet i maskbläddraren, väljer Datafiler, Dödstider på menyn och klickar sedan på Generera dödstider för det aktuella experimentet. LSM kommer att generera en utdatafil med experimentets överlevnadsdata, som kommer att sparas i resultatkatalogen.
   2. Om anteckningar för hand har utförts på storyboarden visas en fråga i maskbläddraren om hur anteckningar ska hanteras för hand. Klicka på "Omedelbart" för att inkludera anteckningar för hand i den utmatade dödstidsfilen.
      OBS: Mortality datafiles skrivs till resultatkatalogen som anges i imageserver.ini file. En mängd olika filer skrivs, men den vanligaste versionen är "survival_simple/survival=machine_hand", som innehåller alla manuella anteckningar som gjorts med hjälp av storyboarden.
   3. Analysera dödlighetsdata i valfri statistikprogramvara.

Figur 5: Storyboard för djur i maskbläddraren. (A) Alla stationära maskar visas i kronologisk ordning efter maskinkommenterad dödstid. För att navigera i storyboarden, tryck på knapparna i (B) nedre högra hörnet och (C) spara anteckningarna ofta. (D) Bilderna med en icke-grå bakgrund visar två maskdödsfall (tidig död som grön, senare död som röd), som antingen kan inträffa när två maskar dör nära varandra, eller när döda maskar flyttas av en förbipasserande mask och därmed upptäcks som döda två gånger. (E) En röd tagg i det nedre hörnet av en bild identifierar maskar med en upptäckt dödstid; (F) En grön etikett anger var ett föremål inte har stått stilla tillräckligt länge för att registrera en dödstid. (G) Flera maskar i samma bildruta kan flaggas genom att trycka på skift och vänsterklicka. (H) Objekt som inte är maskar utesluts från analysen genom ett högerklick. (I) Exploderade maskar censureras från analysen genom att klicka på motsvarande bild (ett anteckningsfönster öppnas för hand) och trycka på skift och högerklicka tills ett "djur exploderat"-meddelande visas. Ett skalstreck på 0,5 mm och etiketter läggs ovanpå skärmbilden av ett maskwebbläsarfönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Bild 6: Inspektera objekt och anteckna dödstider i maskbläddraren. Om du vänsterklickar på ett objekt på maskwebbläsarens storyboard öppnas ett nytt gränssnitt och användaren kan inspektera objektets rörelsedynamik. På höger sida visas (A) rörelsepoängen, som kvantifierar objektets rörelse; Detta uppskattas genom förändringen i pixelintensitet mellan på varandra följande observationer. Dessutom, på höger sida, (B) visas förändringen i den totala objektintensiteten, vilket kvantifierar förändringar i objektstorleken. På vänster sida visar den övre stapeln (C) maskinens uppskattning av dödstiden, medan den nedre stapeln är den (D) mänskliga anteckningen för hand. Genom att klicka på valfri punkt i staplarna och trycka på mellanslagstangenten kan användaren förflytta sig genom de tidsramar där masken har avbildats. På dessa staplar representerar rosa den tid som spenderas i kraftig rörelse, rött representerar tiden som spenderas i döden och gult är allt däremellan. Tiden som spenderas i expansion och sammandragning efter dödstiden visas i grönt. Etiketter läggs ovanpå skärmbilden av ett maskwebbläsarfönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7: Sammanfattande statistik för befolkningen i Worm Browser. Populationsstatistik för skannerenheten "obiwan", med ett diagram över överlevnaden (vänster panel) och ett spridningsdiagram över tiden för kraftigt rörelsestopp (VMC) jämfört med dödstiden (höger panel). De plottade är detaljer om (A) ett tillstånd, erhållet från (B) en skanner som uppnåtts genom att först välja (C) överlevnadsgruppering efter stam. (D) De kvadratiska formerna i spridningsdiagrammet visar de handkommenterade händelserna, medan (E) de cirkulära formerna visar de maskinkommenterade händelserna. (F) Manuell anteckning krävs ofta för dödsfall som inträffar tidigt eller (G) sådana där tidpunkten för kraftig rörelseavbrott sammanfaller med dödstiden. Etiketter läggs ovanpå skärmbilden av ett maskwebbläsarfönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Experimentell reproducerbarhet i livscykelanalyser är utmanande och kräver både noggrant kontrollerade experimentella förhållanden och stora populationer för att uppnå tillräcklig statistisk upplösning ^4,36. LSM är unikt lämplig för att kartlägga stora populationer av djur i en konstant miljö med hög tidsupplösning. För att demonstrera LSM:s kapacitet, lyfta fram de avgörande analysstegen och hjälpa forskare att prioritera sina arbetsinsatser, presenterar vi en delmängd av data från ett optimalt, tidigare publicerat experiment²³. På grund av försökets karaktär som ett dos-responstest krävdes ett stort antal djur för att på ett tillförlitligt sätt detektera förändringar i livslängden. För hand skulle detta experiment kräva en intensiv tidsåtgång från flera forskare eller, om det skalades ner, leda till underdrivna resultat. Datasetet mätte kvantitativa förändringar i livslängd efter avlägsnande av RNA-polymeras II (b)-subenhetsgenen (RPB-2), som krävs för transkription av budbärar-RNA. Använda det auxininducerbara systemet³⁷ i C. elegans, märktes det endogena lokuset för RPB-2 med en degronsekvens för att villkorligt ubiquitylera och bryta ned RPB-2 med hjälp av olika koncentrationer av auxin (α-naftaleneättiksyra). Experimentet utfördes på AMP100 [rpb-2 (cer135); eft-3p::TIR-1] med cer135 motsvarande den CRISPR-införda AID-taggen rpb-2::GFPΔpiRNA::AID::3xFLAG²³. Försöksbetingelserna var vid en temperatur på 20 °C och med användning av UV-inaktiverad NEC937 (OP50 ΔuvrA; KanR)³⁸E. Coli. Hermafroditer steriliserades genom att överföra nematoder under det sena L4-stadiet till plattor innehållande 5-fluoro-2-deoxiuridin (FUdR). Nematoder överfördes under dag 2 i vuxen ålder till plattor som innehöll olika koncentrationer av auxin. I den ursprungliga studien visade författarna att i närvaro av auxin förkortade nedbrytningen av RPB-2 livslängden på ett dosberoende^sätt. 

Här visar vi hur datavalidering och annotering efter experimentet bidrar till den slutliga överlevnadskurvan (figur 8). I de sista stegen av bildanalys i Worm Browser storyboard jämförde vi råa överlevnadskurvor som producerades före storyboard-annoteringen med överlevnadskurvorna som producerades efter manuell uteslutning av icke-maskobjekt och även med överlevnadskurvorna som producerades efter annoteringen av både icke-maskobjekt och individuella dödstider (Figur 8A-C). Vi fann att de initiala överlevnadskurvorna som producerades före storyboard-annoteringen (Figur 8A) förvrängdes av den felaktiga inkluderingen av icke-maskobjekt, vilket var tydligast i svansarna på överlevnadskurvorna. Före manuell annotering inkluderade överlevnadskurvorna alla objekt som detekterats av maskinen som potentiella maskobjekt, varav ungefär hälften, på grund av den avsiktligt höga falska positiva frekvensen, var icke-maskobjekt och måste uteslutas manuellt (figur 8D). Detta är avsiktligt, eftersom algoritmerna är kalibrerade för att ha en relativt hög falsk positiv frekvens för att undvika falska negativa, eftersom det är mycket lättare att utesluta felaktigt inkluderade objekt än att söka efter och återställa felaktigt uteslutna objekt. Efter att ha uteslutit icke-maskobjekt under manuell storyboard-annotering var de resulterande överlevnadskurvorna av mycket högre upplösning (Figur 8B,E), och ytterligare manuell annotering av dödstiderna på storyboarden gav förändringar på högst ~4% i den uppskattade medellivslängden. Vi visar därför att avlägsnandet av icke-maskobjekt under LSM:s bildanalyspipeline är det avgörande steget för att få välupplösta överlevnadskurvor.

Figur 8: Effekten av manuell datavalidering på överlevnadskurvor. Nedbrytningen av RPB-2 förkortar C. elegans livslängd i närvaro av auxin (K-NAA: α-naftalenikättiksyra) på ett dosberoende sätt. (A) Överlevnadskurvor plottade från LSM:s råa utdata efter kvalitetskontroll av plattorna och utan manuell annotering av maskobjekten på Worm Browser-storyboarden. (B) Överlevnadskurvor plottade efter manuell annotering av maskobjekten på storyboarden. (C) Överlevnadskurvor plottade efter manuell annotering av maskobjekten och dödstider på storyboarden. (D) Sammanfattning av alla objekt som upptäckts av LSM. De censurerade maskobjekten inkluderade objekt som uteslöts automatiskt (t.ex. på grund av att maskar rörde sig utanför det genomsökta området) eller manuellt av experimentatorn (t.ex. på grund av att maskar sprack). (E) Tabellrepresentation av den uppskattade genomsnittliga livslängden efter annotering av maskobjekt för hand (vänster) och ytterligare anteckning om dödstid för hand (höger). Procentuell skillnad i medellivslängd mellan angränsande grupper med olika auxinkoncentrationer och den statistiska styrkan för detektion. Alla grafer plottades på statistikprogrammet JMP. Uppgifterna för denna figur har anpassats med tillstånd från Oswal et ^al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Genom att gå bortom livslängd som en enda slutpunkt för att studera åldrande, övervägde vi sedan beteendemässigt åldrande och undersökte vilka steg i den postexperimentella bildanalysen som var mest avgörande för att mäta det. Med fokus på förhållandet mellan kraftigt rörelsestopp (VMC) och livslängd jämförde vi LSM-resultatet i olika stadier av bildanalys och validering (Figur 9A-D). Vi fann att icke-maskobjekt uppvisade ett unikt samband mellan den skenbara VMC och livslängden, där de två annoterades som inträffade nästan samtidigt i varje objekt (Figur 9A). Äkta nematoder däremot upphörde vanligtvis att röra sig kraftigt flera dagar innan de dog (Figur 9A). Den här skillnaden i förhållandet mellan VMC och livslängd ger ytterligare ett sätt att snabbt identifiera och utesluta objekt som inte är maskar.

Figur 9: Effekten av manuell datavalidering på analys av kraftig rörelseavvänjning (VMC). (A) Beteendemässiga åldringsdata utan manuell annotering av maskobjekt på Worm Browser-storyboarden, som visar förhållandet mellan dödstiderna och VMC-tiderna i icke-maskobjekt (i svart) kontra maskobjekt (i rött). (B) Beteendeåldringsdata plottade efter manuell annotering av maskobjekt på storyboarden. (C) Beteendemässiga åldringsdata plottade efter manuell annotering av maskobjekt och dödstider på storyboarden. (D) Tabellrepresentation av den genomsnittliga återstående livslängden (ARL; erhållen från skärningen mellan dödsåldern och VMC-åldern) över olika steg i bildanalyspipelinen och procentuell skillnad i ARL mellan maskobjektsannotering och ytterligare dödstidsannotering. (E) Grafisk representation av de uppskattade ARL-värdena för olika steg i analysen av insamlingen efter bilden och deras förhållande till maskens livslängd (som är beroende av auxinkoncentrationen: α-naftalerättikasyra). Splinepassningen utfördes med hjälp av en cubic spline-metod. Alla grafer plottades på statistikprogrammet JMP. Uppgifterna för denna figur har anpassats med tillstånd från Oswal et ^al.23. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Vi fann att annotering och uteslutning av icke-maskobjekt med hjälp av Worm Browser var tillräckligt för att ge en grov uppskattning av förhållandet mellan VMC och dödstider (Figur 9A-C), vilket rekapitulerar den förväntade dynamiken i den fysiologiska nedgången hos nematoder²³. För att ytterligare utforska detta tog vi hänsyn till samma RNA-polymeras II-datauppsättning och uppskattade den genomsnittliga återstående livslängden (ARL) efter VMC för varje subpopulation som avlyssning av en linjär regressionsmodell som relaterar livslängden till VMC. För att förstå effekten av dataannotering på ARL räknade vi om ARL efter varje steg i dataannoteringen (figur 9E). Vi fann att den manuella annoteringen av dödstider i beteendemässig åldrandeanalys var särskilt viktig för långlivade maskar, i detta fall de som exponerades för de lägsta koncentrationerna av auxin (Figur 9D,E). I motsats till dess minimala effekt på överlevnadskurvorna hade manuell annotering av dödstiderna en betydande effekt på det kvantitativa förhållandet mellan VMC och livslängd, vilket ökade den uppskattade ARL, till exempel vid 0 μM auxin, från 8,09 dagar till 10,42 dagar efter dödstiden. detta motsvarar en ARL-skillnad på 29 %. Därför fann vi att sambandet mellan VMC och dödstider som förklarades av ARL var mycket känsligare för handnotering av dödstiderna jämfört med mätningar av dödstider för enbart livslängd. Denna känslighet kan förklaras av ARL:s relativa varaktighet och livslängden; Samma justeringar av dödstiden kommer vanligtvis att vara små i förhållande till livslängden men stora i förhållande till ARL. Således kommer justeringar av dödstiderna att ha en större relativ effekt på ARL jämfört med livslängden.

Tilläggsfil 1: Struktur för experimentschemafilen Lifespan Machine. Experimentschemat består av tre delar. Först inkluderas den grundläggande informationen om experimentet, till exempel namn och avbildningsspecifikation. Från den här delen behöver i allmänhet bara namnet på experimentet ändras för varje nytt experiment. Den andra delen av dokumentet genereras genom att skanningsområden exporteras från maskbläddraren och anger den fysiska platsen för skanningsområdena för varje skanner ("asuna", "bulma", "moskva", "rio", "yuno" och "yuki" i det här exemplet). Dessa byts ut för varje nytt experiment och kopieras från TXT-filerna som genereras för varje skanner individuellt under steg 4.1.2.3. Den tredje delen av dokumentet innehåller information om experimentets varaktighet, som också bör ändras för varje nytt experiment, och fångstfrekvensen. Enheten kommer att skanna varje definierat område ett i taget med angivna intervall under hela experimentet. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Här tillhandahåller vi ett detaljerat, tillgängligt protokoll för att utföra ett experiment med den senaste versionen av Lifespan Machine. Vi har visat att det kritiska steget för att uppnå välupplösta överlevnadskurvor är manuell uteslutning av icke-maskobjekt under bildtagning. Manuell annotering av dödstid har en liten effekt på överlevnadskurvornas övergripande form, vilket visar att helautomatisk uppskattning av dödstiden är effektiv även utan manuell annotering (figur 8). Tvärtom kräver inhämtandet av högkvalitativa beteendedata om åldrande mer noggranna noteringar av dödstiderna, särskilt hos långlivade individer (figur 9). Därför kommer den tid som krävs för att göra storyboard-anteckningar för hand i slutändan att bero på det specifika resultatet som mäts. Sammantaget finner vi att när man arbetar med LSM är forskarens insatser mest avgörande under den experimentella uppställningen och, i mindre grad, under analysen efter bildinsamlingen. Slutligen lyfter vi fram värdet av automatiserade analyser med hög genomströmning för att producera högupplösta överlevnads- och beteendeåldringsdata samtidigt som forskarnas produktivitet ökar och stöder experimentell reproducerbarhet.

LSM hyser nematoder på agarplattor och återskapar den klassiska livslängdsanalysen för hand i ett automatiserat sammanhang. Andra verktyg har utvecklats för att automatisera mätningen av livslängden hos C. elegans med hjälp av olika metoder för nematodinneslutning. Dessa inkluderar metoder där enstaka nematoder hålls i fasta medier (WorMotel¹⁵) eller i en mikrofluidisk enhet (Lifespan-on-a-chip¹¹) eller de som spårar en större population av djur med hjälp av mikrofluidik (WormFarm¹⁴). Fördelarna med mikrofluidikplattformar inkluderar möjligheten till exakt miljökontroll i realtid och automatisk borttagning av avkommor genom storleksuteslutning. De ovan nämnda enheterna har dock hittills inte visat sig vara lätta att skala, eftersom de kräver omfattande manuell hantering och ofta förlitar sig på daglig bild- eller videoinspelning som utlöses av en experimentalist. Andra plattformar, som Stress-Chip³⁹, använder de modifierade flatbäddsskannrar som är utformade för LSM för att avbilda anpassade mikrofluidiska enheter.

Till skillnad från andra metoder har LSM omfattande dataannoterings- och valideringsmöjligheter, vilket gör det möjligt för användare att systematiskt utföra den kvalitetskontroll som krävs för att samla in högupplösta, exakta och korrekta livslängdsdata i ett sammanhang med hög genomströmning¹³. Tekniken är mångsidig på grund av dess användning av nuvarande agarplattbaserade laboratorieprotokoll och erbjuder en unik fördel för experimentell skalbarhet på grund av den relativa lättheten att ställa in stora grupper av flatbäddsskannrar. Även om LSM kräver en initial tidsinvestering för att bygga och driva och utbilda användare i den specialiserade programvaran, balanseras dessa kostnader av den robusta produktionen av livscykeldata med hög genomströmning. Lifespan Machine-kluster med 50 skannrar eller fler har distribuerats i flera laboratorier och körts kontinuerligt i mer än ett decennium⁴⁰.

LSM har begränsningar. Djuren hålls i skannrar under den automatiserade insamlingen av överlevnadsdata, vilket begränsar forskarnas möjligheter att utföra experimentella ingrepp samtidigt med observationer och kräver antingen sterilisering av djuren eller påbörjande av försök efter nematodernas reproduktionsfas. Temperaturförändringar är ett sällsynt undantag från begränsningen av ingrepp, eftersom omgivningstemperaturen kan moduleras utan att skannrarna behöver öppnas och djuren behöver komma åt. I de fall där praktiska ingrepp måste tillämpas på nematoderna mitt i livet är en vanlig lösning att skjuta upp starten av automatiserad observation tills den nödvändiga hanteringen av djuren har utförts. Dessutom finns det en inneboende variation i placeringen av plattor inom och över skannrarna. Dessa kan vara föremål för små, lokala skillnader i miljöförhållanden (t.ex. i temperatur, ljus, ventilation etc.), vilket kan påverka C. elegans livslängd¹⁹. Denna miljöpåverkan kan kvantifieras ytterligare och studeras med hjälp av regressionsmodeller för accelererad feltid⁴¹. Ett sätt att mildra denna effekt är att helt enkelt skala antalet plattor och skannrar för att uppnå en rigorös mätning oberoende av miljöfluktuationer. Vanligtvis är plattor med samma tillstånd slumpmässigt fördelade inom varje skanner, och populationsstorlekar större än 500 individer per tillstånd och mellan skannrar har visat statistiskt robusta överlevnadsuppskattningar³¹.

Sammantaget möjliggör LSM insamling av överlevnads- och beteendeåldringsdata med hög noggrannhet och stor population, och kan göra det möjligt att utföra tidigare ogenomförbara screeningar på ett kvantitativt sätt. På detta sätt bidrar LSM med ett stort tekniskt framsteg för den standardiserade insamlingen av överlevnadskurvor och ger ett nytt ramverk för kopplade studier av livslängd och beteendemässigt åldrande hos nematoder.